大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成

【目的】获得高纯度大肠杆菌holo-ACP和多种长链脂酰ACP,为研究细菌脂肪酸、类脂A和N-酯酰高丝氨酸内脂等物质的合成提供底物。【方法和结果】采用PCR方法扩增得到大肠杆菌酰基载体蛋白基因(acpP)和holo-ACP合成酶基因(acpS)。使用载体pBAD24、pBAD34和pET28b分别克隆了acpP和acpS,得到pBAD-ACP、pET-ACP和pET-ACP-ACPS3个ACP表达质粒和一个AcpS表达质粒pBAD-ACPS。分别用3个ACP表达质粒转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),构建了DH5α/pBAD-ACP、BL21(DE3)/pET-ACP和BL21(DE3)/pET-ACP-ACPS3种ACP生产菌株。与holo-ACP纯化常用菌株DK574相比,虽然三菌株在诱导时均能过量表达ACP,但是holo-ACP所占比例偏低。为了提高ACP生产菌株holo-ACP的产量,用质粒pBAD-ACPS分别转化上述3种ACP生产菌株,获得了3种携带双质粒的ACP生产菌株。表达结果显示携带pBAD-ACP和pBAD-ACPS双质粒的DH5α菌株比DK574菌株能产生更多的holo-ACP,且纯度也得到提高(纯度达99%)。同时使用UNOsphereQ阴离子交换层析从这一菌株培养物中分离纯化到了高纯度的holo-ACP,并以纯化到的holo-ACP和多种长链脂肪酸为底物在哈氏弧菌脂酰ACP合成酶的催化下,合成了多种长链脂酰ACP。【结论】通过研究获得一株holo-ACP高产菌株,并证明在大肠杆菌菌株中,同时表达acpP基因和acpS基因,有利于holo-ACP的产生。