细菌素纯化技术及其应用研究进展

细菌素是一种由细菌在核糖体内合成并释放到胞外,具有抑菌或杀菌效果的多肽。大量研究表明细菌素具有调节肠道微生物种群、抗炎和抗癌等作用。然而,细菌素纯化成本高、产量低且存在一定环境污染是限制细菌素广泛应用的重要因素。提高细菌素的纯化倍数和回收率是其纯化的关键,增加细菌素的比活力和产量对其生产应用至关重要。合理选择纯化技术,可以有效提高细菌素的产量、纯度和回收率。由于细菌素的分子量和带电荷性质具有差异性,应根据其特性选择不同的纯化技术。细菌素的纯化包括粗分离纯化和精细分离纯化,粗分离纯化技术包括硫酸铵沉淀法、有机溶剂萃取法、大孔树脂法和透析法,精细分离纯化技术包括离子交换层析法、凝胶过滤层析法、反相高效液相色谱法等。广泛应用的细菌素纯化技术包括硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱等,并且由这几种技术组合的两步法和三步法纯化技术近几年应用较多。近年来,快速蛋白液相色谱等非传统的纯化技术逐渐应用于细菌素的精细分离纯化。高效、低成本、无污染、绿色环保的细菌素纯化技术是其进一步研究的关键,这些技术难点的突破将为细菌素在医疗领域中的应用奠定基础。本文对细菌素的纯化技术及其应用进行归纳分析,可为细菌素的进一步开发与应用提供参考。

海参自溶酶的分离纯化和部分性质研究

采用硫酸铵分级盐析 ,Sephadex 1 0 0分子筛柱层析从新鲜海参肠中分离纯化海参自溶酶。研究发现 ,所纯化的酶为酸性蛋白酶 ,分子质量约为 68 5ku ;最适作用温度为 3 5℃ ,对热不稳定 ;酶的最适作用pH为 7 0 ;金属离子Pb2 + 、Hg2 + 、Cd2 + 、Mn2 + 对酶的活性有抑制作用 ;Zn2 + 、Mg2 + 、Cu2

花生过敏原蛋白分离纯化方法研究进展

花生中已确定的过敏原蛋白包括Ara h 1～Ara h 11 11种。本文详细介绍花生中主要过敏原蛋白(Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4、Ara h 6)以及非主要过敏原蛋白(Ara h 7～Ara h 11)的分离纯化方法研究进展。花生过敏原蛋白的分离纯化方法包括硫酸铵沉淀法、柱层析法、电泳法。其中硫酸铵沉淀法主要用于粗提纯化过程,而柱层析法则主要用于花生过敏原蛋白的精制,它包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、疏水相互作用层析、高效液相色谱。目前离子交换层析和凝胶过滤层析在花生过敏原蛋白分离纯化中应用最为广泛,而电泳法则仅见应用于Ara h 7及油质蛋白(Ara h 10、Ara h 11)的分离纯化。

虾过敏原蛋白纯化中硫酸铵沉淀法的改进

目的优化虾过敏原蛋白纯化的硫酸铵沉淀工艺,提高纯化效果。方法测定不同饱和度硫酸铵溶液的体积和pH,将过敏原蛋白粉末加入固定饱和度和pH的硫酸铵溶液中沉淀,并用SDS-PAGE方法检测不同硫酸铵浓度下蛋白质组分的变化。结果PH7.5的30%饱和度硫酸铵溶液可有效地分离虾过敏原蛋白,进一步柱层析得到只有一条电泳带的样品。结论通过改进硫酸铵沉淀工艺,可提高虾过敏原蛋白的纯化效果。

牛乳清蛋白中β-乳球蛋白的分离纯化

结合硫酸铵分段盐析和凝胶层析两种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:①在20%～30%、70%～80%盐析段只有两条带,分别是β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白带,得到较纯的蛋白;②再用SephadexG-50凝胶过滤层析,电泳结果显示只有一条带,并与标准β-乳球蛋白带一致,得到较纯的β-乳球蛋白。

猪心肌乳酸脱氢酶的提纯工艺及酶反应最适条件

研究了适合于工业化生产的猪心肌乳酸脱氢酶的初步提取工艺 ,经硫酸铵分级沉淀得到酶的比活为86 5U/mg ,再经DEAE离子交换层析比活可达 5 2 5 0U/mg ,酶活总收率为 5 4 5 % .并对酶促反应的最适条件进行了研究 ,其最适反应pH为 7 6～ 7 8,最适反应底物浓度分别为NADH 5mg/mL和丙酮酸钠 2 5mmol/L .

辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性IgG抗体中的应用

目的从旋毛虫感染的大鼠和兔血清中纯化抗旋毛虫IgG抗体。方法分别用辛酸-硫酸铵法(CA-AS)、硫酸铵沉淀法(AS)纯化旋毛虫感染的大鼠和兔血清中抗旋毛虫IgG抗体。结果IgG抗体纯化率CA-AS法为80.05%～83.22%,AS法为67.00%～71.08%;得率CA-AS法为7.85～8.79mg/ml,AS法为12.04～12.12mg/ml;回收率CA-AS法为52.55%～55.03%,AS法为61.36%～64.87%。CA-AS法得率和回收率均低于AS法,但纯化率高于AS法。ELISA法测定CA-AS法和AS法纯化的抗体效价不变。结论CA-AS法是一种简便?快速?有效的纯化血清IgG抗体的方法,可用于大鼠和兔血清抗旋毛虫IgG抗体的纯化。

贵州豆豉纤溶酶发酵液中活性酶的盐析分离纯化

目的:对贵州豆豉发酵液中纤溶酶分离纯化。方法:贵州特色药食两用的豆豉中提取得到的纤溶酶菌株(DCK-B),用液体发酵法将其发酵,采用硫酸铵盐析法进行粗提纯,并对0～80%浓度的一级硫酸铵梯度盐析与0～30%、30%～60%两段硫酸铵梯度盐析的结果进行比较。结果:硫酸铵梯度盐析在30%以前出现的沉淀为杂蛋白,且较复杂;30%梯度以后的目标蛋白大量沉淀出来,到50%时活性蛋白几乎沉淀完全;经两段盐析,当0～30%盐析时有少量活性蛋白盐析出来,绝大部分蛋白在30%～60%这个盐析梯度沉降下来。结论:确定了贵州豆豉纤溶酶发酵液中活性酶的两段硫酸铵盐析分离纯化方法。

原核表达重组牛凝乳酶的纯化

原核表达获得的重组牛凝乳酶与商品重组牛凝乳酶有相似的酶学特性,具商业潜力,故进一步研究其纯化方法。使用离心与饱和硫酸铵沉淀,成功纯化出有活性的重组牛凝乳酶。蛋白最终回收率为1.82%,总活力比纯化前提高了73.3%,比活力提高了95.3倍。同时,讨论了如何提高包涵体复性率与产物回收率,为今后该酶的工业化生产提供技术参考。

DNA重组酶FLP原核表达与多步法纯化及其活性检测

DNA重组酶FLP存在于酵母2μ质粒上，能识别34bp的FRT位点，并根据2个FRT位点的相对方向完成位点间DNA序列的交换、重组、删除与逆转，在现代分子生物学理论研究与基因工程技术开发中具有广泛应用。构建了在原核大肠杆菌中高效表达FLP重组酶的表达载体pQE32-flpe并建立起相应的原核高效表达体系，在原核细菌大肠杆菌M15菌株中实现FLP酶蛋白的高效表达，同时建立了相应的纯化方法。纯化时先用硫酸铵沉淀法富集FLP酶蛋白，经透析脱盐后再用镍离子鳌合微柱（0．5—1．0mL）亲合层析梯度洗脱的方法获得纯化的FIJP酶蛋白。通过构建含有2个方向相同的FRT序列位点的质粒pUC18-FRT-gfp-FRT和含有1个FRT位点的表达载体pET30a-FRT，并分别以其为底物来检测FLP重组酶的删除、交换与重组功能的活性。结果表明，该方法不仅能有效表达FLP酶蛋白，并能行之有效地纯化FLP酶蛋白，以及检测纯化的FLP酶蛋白对DNA序列的删除、重组与交换功能。该方法简单易行并能获得有活性的FLP酶蛋白，为深入研究其机理以及研发相应的DNA重组技术提供重要参考。

阴离子交换柱(DEAE-52)层析纯化海参自溶酶

本研究针对海参自溶酶的特点,经过实验确立了以下纯化方案:首先将海参湿肠打浆,再用0.1mol/L,pH6.3磷酸盐缓冲溶液浸提,离心弃沉淀得上清液;然后将乙醇加入到上清液中,使其浓度达30%,离心取沉淀。最后采用阴离子交换柱(DEAE 52)层析,得到在SDS 聚丙烯酰胺电泳(SDS PAGE)上表现为一条带的海参自溶酶样品。

解淀粉芽孢杆菌ASR-12抗菌蛋白的分离纯化及其编码基因克隆

为了从菌株ASR-^12发酵液中分离纯化获得抗菌蛋白。将菌株ASR-^12发酵液经硫酸铵沉淀、透析除盐后获得粗蛋白,粗蛋白进行热处理和Q Sepharose Fast Flow柱层析,纯化后的蛋白进一步进行LC-MS鉴定,并克隆其编码基因进行测序。粗蛋白经热处理和柱层析后得到5个吸收峰,活性检测结果显示峰Ⅳ具有较高抑菌活性,经SDS-PAGE检测显示为单一条带,分子量约为50k Da。LC-MS鉴定结果显示抗菌蛋白与M42家族肽酶同源性最高,覆盖度达到80%;并能从菌株ASR-^12基因组中克隆到M42家族肽酶编码基因,测序结果经BLAST比对与解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2的M42家族肽酶编码基因同源性达100%。菌株ASR-^12产生的抗菌蛋白中,M42家族肽酶为主要活性成分。

两种粗提纯法对纤溶酶纯化效果的比较研究

采用硫酸铵盐析法及乙醇沉淀法对海洋枯草芽孢杆菌纤溶酶的纯化效果进行比较研究,得到的最佳纯化方案为:取一定体积的纤溶酶发酵液进行预处理,再进行分段盐析及分级沉淀,在分段盐析中,30%和70%饱和度的硫酸铵分别用于去除杂蛋白和沉淀纤溶酶,最后进行碱处理及超滤除盐;在分级沉淀中,最佳乙醇沉淀时间为1.5 h,去除杂蛋白和沉淀纤溶酶的乙醇体积比分别为25%和165%,最后将两种方法得到的粗提液进行冷冻干燥,硫酸铵法的酶活回收率为83.52%,纯化倍数为1.42,冻干粉得率为4.812 g/L,单位酶活为76 755.82 IU/g;乙醇纯沉淀法的酶活回收率为89.7%,纯化倍数为1.72,冻干粉得率为7.611 g/L,单位酶活为137 190.57 IU/g,该结果表明乙醇沉淀法对纤溶酶的粗提效果要优于硫酸铵盐析法。

脱盐牛乳乳清粉中β-乳球蛋白的分离纯化

结合硫酸铵分级盐析、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析三种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:1在质量分数为75%盐析段与其他成分相比含有较多的β-乳球蛋白;2用阴离子交换层析进行进一步的分离,经过两次的阴离子交换层析可得到较高纯度的β-乳球蛋白;3再用Sephadex G-10凝胶层析,电泳结果显示只有一条带,并与β-乳球蛋白标准品(纯度95%)带一致,得到高纯度的β-乳球蛋白。

优化硫酸铵法纯化单克隆抗体

改进硫酸铵法纯化单克隆抗体,优化硫酸铵的饱和度,让最终饱和度达45%,通过两次沉淀,使单克隆抗体的纯度进一步提升,再利用醋酸缓冲液去除杂蛋白,最终得到便于保存的单克隆抗体。优化后的硫酸铵法提取出蛋白质的纯度大大提高,且浓度和效价都高于传统方法,能纯化出与亲和层析纯度相媲美的单克隆抗体。优化后的硫酸铵沉淀法简单便捷,易于操作且纯化抗体纯度高,也便于抗体保存。

一种安全高效的血红蛋白纯化方法

目的:建立一种适用于大量制备的,安全、高效的血红蛋白纯化方法。方法:将压积红细胞装入透析袋,以含有还原剂的Tris缓冲液透析破碎,破碎的上清经两级硫酸铵沉淀后透析至上样缓冲体系,离心后取上清即得血红蛋白提取液;红细胞提取液通过阴离子交换柱层析进一步分离,计算回收率。纯化产物浓缩后以SDS-PAGE及HPLC鉴定纯度,进行紫外-可见光谱扫描并以ABL800血气分析仪分析血气指标,以鲎试剂测定内毒素含量,以磷测定法测定脂质含量。结果:血红蛋白提取液中脂质去除率98%,容易通过0.45μm滤膜;经阴离子交换层析纯化的血红蛋白经SDS-PAGE(银染法)及WB分析没有杂蛋白条带,HPLC分析纯度>99%、总回收率>85%;内毒素含量<2 EU,高铁血红蛋白含量<5%。结论:该血红蛋白纯化方法安全高效、成本低廉、易于放大生产,具有较好的应用前景。

三聚氰胺单克隆抗体不同纯化方法的比较

为了建立更适用于三聚氰胺单克隆抗体的纯化方法,分别采用了硫酸铵两次沉淀法、正辛酸-硫酸铵沉淀法、凝胶过滤层析法、亲和层析法、阴离子交换层析法对三聚氰胺单克隆抗体进行纯化。对纯化后的三聚氰胺单克隆抗体的纯度、浓度、效价进行鉴定,对比不同纯化方法之间的差异。结果证明亲和层析法对于三聚氰胺单克隆抗体纯化最为适宜。由于亲和层析法纯化纯度高,快速便捷,对三聚氰胺单克隆抗体损伤小,最为推荐。研究者也可结合自身条件,参考文中数据结果,根据实验需要自行选择适合自身的纯化方法。

酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

【背景】Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25-42°C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45°C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH9.0时稳定性最高;0.5-20.0mmol/L浓度范围内的Mg^2+对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg^2+可使该酶酶活力提高约23%;Ba^2+、Co^2+、Ca^2+、Mn^2+、Cu^2+、Fe^2+、Zn^2+对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu^2+和Fe^2+对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。