转基因大麦B-hordein基因荧光定量PCR方法的建立

为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达,利用SYBR Green I染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量,通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段,对PCR退火温度、引物浓度等进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明,转基因大麦B-hordein基因表达量较对照品种Golden Promise显著降低(P<0.05),B-hordein和actin扩增片段分别在(84.51±0.01)℃和(80±0.01)℃处显示特异性单峰,可成功建立转基因大麦B-hordein SYBR Green I实时定量PCR法。

青稞B-hordein基因对小麦面粉加工特性的影响

B组醇溶蛋白是大麦的主要贮藏蛋白之一,其组成及含量与大麦的营养品质和加工品质密切相关。为探究大麦B组醇溶蛋白对小麦面粉加工特性的影响,以转青稞B-hordein基因的小麦转基因高代株系(T4、T5代)及其受体品种龙麦30为材料,分别对转B-hordein基因小麦高代株系及龙麦30进行分子检测、农艺性状测量、近红外分析和粉质分析。结果表明,转B-hordein基因小麦高代植株均为阳性植株;在农艺性状方面,转B-hordein基因小麦与龙麦30无显著差异;在品质方面,转B-hordein基因小麦的蛋白质含量、湿面筋含量的平均值均极显著高于龙麦30;粉质分析结果也表明转B-hordein基因小麦的粉质参数优于龙麦30。由此推测,B-hordein基因的成功转化能够改善小麦的面粉加工特性。

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条(Gp4和Gp5),测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18和iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T2/T3转基因大麦基因组。随机选取6个T3转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%—55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T1和T3籽粒进行蛋白质含量测定表明8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN2及HN3处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移(HN2到HN3),该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。

利用RNAi技术沉默大麦B-Hordein基因的研究

为限制大麦籽粒中贮藏蛋白的积累,降低其蛋白质含量,以大麦幼胚为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将大麦B组醇溶蛋白基因gp4/antisense gp4片段与Ubi启动子相连导入大麦,经PCR检测证实,含有gp4反向重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入大麦。RT-PCR结果表明,转基因株系中B-Hordein mRNA积累受到明显抑制。收获T1代籽粒,经近红外谷物分析仪测定表明,2个转基因大麦株系籽粒蛋白质含量(分别为11.4%、11.7%)较对照(12.3%)降低。因此,利用RNA干涉技术降低大麦蛋白质含量是可行的。

Protein and hordein fraction content in barley seeds as affected by sowing date and their relations to malting quality

The effect of sowing date on grain protein, hordein fraction content and malting quality of two-rowed spring barley was investigated by using ten commercial cultivars with different grain protein content and the relationships among these traits were examined. The results showed that grain protein content and B hordein content increased as the sowing date postponed and were significantly affected by sowing date, while C and D hordein contents were less influenced by sowing date. There were significant differences in grain protein and hordein fraction content among the ten cultivars. The coefficient of variation of D hordein content was much larger than that of B and C hordein contents, suggesting its greater variation caused by different sowing dates. Beta-amylase activity and diastatic power were also significantly affected by sowing date, with malt extract being less affected. Significant differences in measured malt quality were found among the ten cultivars. Grain protein was significantly correlated with B hordein and malt extract positively and negatively, respectively. There was no significant correlation between beta-amylase activity or diastatic power and grain protein content. B hordein was negatively and significantly correlated with malt extract, but no significant correlations between C hordein, D hordein and malting quality traits.

青稞B-hordein基因表达载体构建及对小麦的遗传转化

利用从具有特殊B-hordein亚基组成的青藏高原青稞材料中克隆的B-hordein编码基因(SL60)和小麦高分子量谷蛋白亚基胚乳特异表达启动子PGlu1Dx构建了真核表达载体pCB2007-SL60.通过农杆菌介导对普通小麦进行遗传转化,共获得227株再生植株,经PCR鉴定和转化片段测序验证,最终获得5株阳性植株.研究为进一步分析B-hordein基因在小麦背景中的遗传和表达,以及对小麦加工特性的影响奠定了基础.

18个大麦品种醇溶蛋白基因的比对和序列分析

为探究大麦B-醇溶蛋白的生物学特征,对来自美国、墨西哥以及国内不同省份的18份大麦品种的B-醇溶蛋白基因进行了克隆和分析。结果表明:20个包含完整编码区的基因序列,14个为编码基因,6个为假基因;与GenBank注册的45个序列进行对比,各基因之间的相似度为82.9%–99.8%,说明这20个基因序列全部是新基因或新的单元型;14个编码基因的推断氨基酸序列表明,其中13个基因含有8个保守的半胱氨酸残基,只有一个含有7个半胱氨酸残基,这在大麦中是首次发现;基因进化树分析表明,20个B-醇溶蛋白基因中有19个V型,只有一个H型且没有Y型。本研究为促进大麦B-醇溶蛋白基因数据的发表提供了基础,同时也可以为大麦B-醇溶蛋白基因研究提供参考价值。

大麦中的重要蛋白质及其对啤酒酿造的影响研究进展

大麦作为重要的谷类作物,在饲料生产和食品加工中占有重要地位,其中大麦籽粒中所含的蛋白质对啤酒酿造过程及啤酒品质有重要的影响,尤其是啤酒泡沫、啤酒浑浊等。然而,目前对于大麦中起重要作用的蛋白质如大麦醇溶蛋白、热稳定性蛋白(蛋白质Z和脂质转移蛋白)等的研究还较少,结构方面的信息有所欠缺,功能的开发也处于起步阶段。本文主要从大麦中重要的蛋白质出发,对大麦中蛋白质的结构、功能性质和应用进行综述,并概述其在啤酒酿造中的作用及变化,以期拓宽其在生产加工中的应用、为大麦中蛋白质的加工和利用提供理论参考。

负载白藜芦醇的大麦醇溶蛋白/海藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒的制备及表征

以大麦醇溶蛋白(hordein)、海藻酸丙二醇酯(PGA)为原料,通过溶剂蒸发法制备大麦醇溶蛋白-海藻酸丙二醇酯复合纳米颗粒(Hordein/PGA),并对白藜芦醇进行包封。结果表明,随海藻酸丙二醇酯添加量的增加,Hordein/PGA的粒径由1654.9 nm逐渐下降至475.9 nm。同时Hordein/PGA的电位均为负值,并随海藻酸丙二醇酯添加量的增大由-3.62 mV下降至-8.04 mV。红外光谱结果显示:大麦醇溶蛋白与海藻酸丙二醇酯主要通过氢键、静电吸引及疏水相互作用结合。以Hordein/PGA1∶1对白藜芦醇进行包封,构建三元复合纳米颗粒(Hordein/PGA/Res),白藜芦醇的包封率可达87%。红外光谱和X射线衍射分析表明白藜芦醇与大麦醇溶蛋白、海藻酸丙二醇酯有效结合。Hordein/PGA/Res经85℃处理30 min后白藜芦醇保留率为88%,显著高于游离白藜芦醇保留率(73%);经6 h紫外光辐射处理后白藜芦醇保留率可提高约16%。

甘青乌头的生物碱

从甘青乌头 (AconitumTanguticum(Maxim)Stapf.)中分出五个生物碱 ,其中一个为新生物碱 ,命名为Tangutimine ,四个为已知生物碱 ,分别为 :Hetisinone、Talatizamine、Atisine、Hordeine。经IR ,MS ,1H和13 CNMR以及 2DNMR的测定 ,确定了它们的化学结构。其中Talatizamine。

青稞B组醇溶蛋白基因5′上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制，为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础，以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板，根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白（B-hordein）基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物，分别与随机简并引物配对，进行热不对称嵌套PCR（Thermal asymmetric interlaeed PCR，TAIL-PCR）扩增，从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列。序列测定结果表明，两个扩增片段长度分别为395和396bp，加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198bp的长度，则可得到约600bp的B-hordein基因5’上游调控序列。将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对，所得序列与来自野生智利大麦（H．chil-ense）的B3-hordein基因（Genbank登录号：AY998010）、普通小麦（T.aestivum）的低分子量麦谷蛋白亚基基因（Genbank登录号：X07747）和栽培大麦（H．vulgare）的B-hordein基因（Genbank登录号：X03103）具有81％～95％的序列相似性。推测其TATAbox位于-80bp，CAAT-likebox位于-140bp处。另外，在-300bp处存在一个胚乳盒（EndospermBox，EB），包含EM基序和GCN4基序。EM基序高度保守，GCN4基序有一个核苷酸位点的突变。此外，在约-560bp处存在一个胚乳盒类似结构。

西藏野生大麦醇溶蛋白的遗传多样性

作者利用A PAGE(Acid polyacrylamidegelelectrophoresis)法研究了来自中国西藏的野生二棱大麦、野生瓶形大麦和野生六棱大麦共106份材料在3个醇溶蛋白位点的遗传多样性.结果表明,所有供试材料在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组醇溶蛋白位点分别发现了26、14和22种等位变异类型,平均等位变异数大小顺序为:野生二棱大麦,野生瓶形大麦,野生六棱大麦.这些等位变异类型的频率在这3组野生大麦间的分布存在显著或极显著差异.野生二棱大麦平均遗传多样性程度极显著地高于野生六棱大麦,这3组大麦间存在明显的遗传分化.最后,讨论了栽培大麦的起源中心及中国栽培大麦的起源与进化问题.本研究结果表明,野生二棱大麦是栽培大麦的祖先,支持了栽培大麦起源的"二棱大麦单系发生论".

种子老化诱导小麦染色体畸变及大麦醇溶蛋白带型频率变化的研究

通过对 2 0份小麦种质发芽率和根尖细胞染色体畸变的测定 ,结果表明同一品种贮藏于中期库的低发芽率种质 ,其染色体畸变率明显高于贮藏于长期库的高发芽率种质。从总体上看 ,种子根尖细胞染色体畸变率与发芽率呈负显著相关 ,而与贮藏年限无显著相关。但对长期库和中期库的种质分别进行统计分析 ,种子根尖染色体畸变率与发芽率和贮藏年限均无显著相关。对大麦地方品种“普乃干木”的醇溶蛋白分析表明 ,该品种有 4种biotype,随着发芽率的下降 ,其群体中的 4种bio type的频率发生了变化 ,当发芽率从 95 %降到 34%时 ,其中一种biotype出现了消失 ,而有一种biotype频率从 83%上升至95 % ,此结果表明 ,种子生活力下降和不同biotype种子存活能力存在差异 。

青藏高原青稞B组醇溶蛋白遗传多样性研究

报道了青藏高原青稞B组醇溶蛋白的遗传多样性.在66份青藏高原青稞材料中,共有15种不同条带、29种不同条带组合,表明青藏高原青稞材料具有丰富的多态性.不同来源的群体材料间遗传多态性存在差异,西藏育成品种的多态性略低于四川农家品种,人工选择使其遗传多态性减弱.聚类分析将材料分成3组,材料聚类与材料来源地没有明显的相关性.

萌发大麦种子内肽酶活力、醇溶蛋白及氨基酸含量变化

以两个大麦品种垦啤8号和Harrington为材料研究了大麦种子萌发过程中体内醇溶性蛋白质、游离氨基酸和内肽酶活力的变化。垦啤8号大麦种子的醇溶蛋白含量高,但其降解量比Harrington多。垦啤8号游离氨基酸增长量略高于Harrington。整个大麦种子发芽期间,国产品种内肽酶活力始终高于进口品种。以上表明,与Harrington相比,虽然国产品种垦啤8号含氮量高,但其内肽酶活力升高快,最大酶活力高,醇溶蛋白降解、转化为可输出氮的进程快,有制造优质麦芽的潜力。

啤酒大麦醇溶蛋白的遗传多样性分析

为合理利用优良种质资源,采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)对44个啤酒大麦品种进行醇溶蛋白的遗传多样性研究。结果表明,44个啤酒大麦品种共分离出33种相对迁移率不同的醇溶蛋白谱带,没有公共谱带,即参试材料在33个醇溶蛋白等位变异位点上均存在多态性。44个啤酒大麦品种共得到29种不同的醇溶蛋白图谱类型,其中24种图谱为单个材料所独有,另外5种图谱分别为几个品种所共有,说明啤酒大麦醇溶蛋白遗传多态性丰富。聚类分析结果与醇溶蛋白多态性分析结果相一致。

基于醇溶蛋白的20份大麦种质资源遗传完整性分析

为了给大麦种质的保存和更新提供依据，采用醇溶蛋白电泳技术对20份大麦种质（每一份种质各有两个繁殖年份不同的供试材料）进行了遗传完整性分析。结果表明，有5份种质是具有一种醇溶蛋白谱带带型的同质性种质，15份是具有2～6种醇溶蛋白谱带带型的异质性种质；同质性品种不同繁殖年份之间的谱带带型没有变化，而在15份异质性种质中有4份的带型数量及频率则发生了变化。说明某些大麦异质性种质在繁殖更新过程中发生了遗传完整性变化。进一步分析表明，更新发芽率水平不是影响带型频率发生显著变化的主要因素，其遗传完整性变化可能是更新发芽率水平、繁殖群体、授粉和收获方式等综合因素的影响结果。

新疆大麦种质资源农艺性状和醇溶蛋白遗传多样性分析

为给新疆大麦种质资源的开发利用和今后新疆大麦高产优质新品种的选育提供依据，根据大麦的8个农艺性状表现，采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A—PAGE）对国内外50份大麦种质资源的农艺性状和醇溶蛋白的遗传多样性进行了分析评价。结果表明，供试大麦品种农艺性状的变异系数（CV％）取值范围在9．15％～41．68％。平均23．96％。多样性指数（日）介于1．400～2．039，平均1．810。各农艺性状的遗传多样性指数都较大。具有丰富的遗传多样性；对供试材料的农艺性状进行聚类分析，50份大麦材料在遗传距离（GD）3．28时可被聚为5大类。利用A—PAGE对50个供试大麦品种进行检测，共分离出21种相对迁移率不同的醇溶蛋白谱带，即参试品种具有21个醇溶蛋白等位变异位点。平均每个品种分离出0．42条多态性谱带，表明这些品种具有丰富的遗传变异；对供试材料的醇溶蛋白电泳结果进行聚类分析，50份大麦材料在遗传距离（GD）0．44处聚为6个大类。

白藜芦醇-大麦醇溶蛋白复合纳米颗粒的光稳定性、缓释行为及抗氧化能力

采用液-液分散法自组装制备了白藜芦醇-大麦醇溶蛋白复合纳米颗粒,其平均粒径为(135.0±2.5)nm,白藜芦醇包封率为90.4%,负载率为18.8%;扫描电子显微镜表征结果显示纳米颗粒表面光滑,呈较规则的圆球状.考察了复合纳米颗粒载体形式对白藜芦醇光稳定性的影响,结果表明,在紫外光下暴露18 h,与游离白藜芦醇相比,纳米颗粒中的白藜芦醇稳定性提高了26%.通过模拟胃肠道环境考察了复合纳米颗粒的白藜芦醇缓释行为,结果表明,2 h内白藜芦醇在模拟胃液中的释放率为35%,随后释放速率减慢,6 h后的释放率为56%;在模拟肠液中2 h内白藜芦醇的释放率为42%,且在4 h内的释放行为遵循零级释放特征,6 h后的释放率为88%.对游离态白藜芦醇和复合纳米颗粒形式的白藜芦醇抗氧化能力进行了对比研究,1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)实验结果表明,复合纳米颗粒形式的白藜芦醇比游离形式在清除氢过氧自由基方面能力稍强(IC50值分别为0.4182 mmol/L和0.4378 mmol/L);Hep G2细胞抗氧化模型实验进一步证实白藜芦醇在形成复合纳米颗粒后其抗氧化能力略有增强.

不同提取剂对麦醇溶蛋白提取效果的电泳比较

以大麦、小麦品种为材料 ,分别采用醇溶蛋白提取剂乙醇、乙二醇、2 -氯乙醇、2 -巯基乙醇、尿素等配成不同浓度的单一组分提取剂和复合提取剂 ,在同一条件下提取大麦和小麦去胚种子的醇溶蛋白 ,通过 A- PAGE分离样品液发现 ,单一组分提取剂中 2 5 %的 2 -氯乙醇效果较好 ,5 %的 2 -巯基乙醇效果较差 ;复合提取剂中由 2 -氯乙醇和2 -巯基乙醇组成的提取剂效果最好。这种复合提取剂制备的样品液经电泳后 ,在图谱中条带丰富 ,带型清晰 ,无论对大麦还是小麦种子 ,都是最佳的醇溶蛋白提取剂。