HOXB4基因在造血干细胞自我更新中的调控作用

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)具有高度自我更新能力和多向分化潜能,HSC的自我更新是由促进生长的正调控信号和导致凋亡的负调控信号之间的平衡来调控的。在正调控信号中,HOXB4通过激活不同的信号通路增强HSC的自我更新,同时又不影响维持正常稳态造血的调控机制。提高HOXB4的表达水平,能够极大地增强HSC的自我更新功能,但基本不影响细胞的分化、系特异性及终末细胞的形态和功能。不仅如此,HOXB4还可增强胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的造血潜能,促进ESC向造血细胞分化。因此,HOXB4和(或)HOXB4的靶基因的表达上调可能在干细胞移植和基因治疗等方面具有广阔的应用前景。本文就HOXB4基因参与调控造血干细胞的自我更新,HOXB4对HSC的分化特异性及终末分化的"零"效应及HOXB4调控HSC自我更新的分子机制等进行综述。

HOXB4基因及其在造血干细胞增殖分化调控中的作用

OX家族基因编码一类转录因子 ,参与造血干 /祖细胞的发育调控。其家族成员HOXB4基因具有独特作用。通过提高其表达水平 ,可以在体内外大量扩增造血干细胞。与此同时基本不影响细胞的分化、系特异性及终末细胞的形态和功能。不仅如此 ,HOXB4还可增强胚胎干细胞 (ES细胞 )的造血潜能 ,促进ES细胞向造血细胞分化。因此 ,HOXB4无论是用于基因治疗还是干细胞治疗 。

FLASH基因在野生型斑马鱼早期表达以及与HoxB4基因的关系

目的:观测FLASH基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎早期的表达及与Hox B4基因的关系。方法:以Hox B4转基因斑马鱼系为研究对象,分为实验组、实验对照组和空白对照组,实验组为Hox B4转基因斑马鱼系与Cre鱼系交配所得的过表达Hox B4的带有EGFP荧光的胚胎(Tg:Lmo2-Cre,Lmo2-LDEL-Hoxb4-EGFP),实验对照组为EGFP转基因斑马鱼系与Cre鱼系交配所得的表达EGFP荧光的胚胎(Tg:Lmo2-Cre,Lmo2-LDEL-EGFP),空白对照组为Tuebingen野生型斑马鱼的胚胎;采用FLASH反义mRNA探针做原位杂交并观察其表达。结果:观察到Tuebingen组中3. 7、9～24 hpf的神经外侧板、头部和脊索及18～30 hpf的原肾管可见黑色的阳性杂交信号,36 hpf后未见; 18～72 hpf的空白对照组与实验对照组间FLASH表达水平无差异,实验组18～30 hpf神经系统、造血系统FLASH的表达下调。结论:FLASH基因可能是Hox B4基因的下游靶基因。

造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达

背景:HOXB4基因不仅能促进造血干细胞的扩增及其功能的活化与表达,而且体内试验表明它不会诱发白血病。因此更好地研究HOXB4在造血细胞增殖分化中的变化及作用对进一步研究造血干细胞的扩增可以提供更多的理论基础。目的:观察人类脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因表达的情况及全反式维甲酸对HOXB4基因表达的影响。方法:将培养的淋巴系造血祖细胞按干预方式不同分为2组,全反式维甲酸组:在培养体系中加入全反式维甲酸,终浓度6×10-8mol/L。正常组:不加全反式维甲酸,代之以等量的1640培养液。观察人类脐血造血干细胞经植物血凝素诱导后,在培养第3,7,12天的淋巴细胞集落形成单位生成情况。采用实时荧光定量PCR技术检测脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达水平。结果与结论:人脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中,HOXB4基因呈规律的表达。随培养时间推移,正常组和全反式维甲酸组HOXB4基因的表达均逐渐降低。与正常组比较,全反式维甲酸可上调HOXB4基因的表达。

全反式维甲酸对脐血红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因表达的影响

本研究探讨全反式维甲酸(ATRA)对人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程进行干预后hoxb2、hoxb4基因表达的影响。取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及FQ-RT-PCR方法,以6×10-8mol/L的ATRA干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化的过程,进而检测空白对照组、ATRA组在培养的第3天、第7天和第10天红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因表达情况。结果表明:本实验各组的hoxb2、hoxb4基因在第3天时开始少量表达,在第7天表达明显升高,而在第10天表达最强烈。在空白对照组中,第3天、第7天、第10天hoxb4基因相对表达量较hoxb2高。与空白对照组相比较,ATRA组Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加。结论:hoxb2、hoxb4基因在脐血HSC向红系定向增殖分化过程中(体外)均有表达,说明hoxb2、hoxb4均与红系造血有相关性,且与hoxb2相比,可能hoxb4与红系造血相关性较大;6×10-8mol/L的ATRA能显著上调正常红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因的表达。

基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型,进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sg RNA,分别靶向ExonⅠ的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成sg RNA的寡核苷酸序列,经过酶切克隆进p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化然后在体外转录得到Cas9的m RNA并进行加A尾,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取基因组DNA,PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PC R鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示,靶位点的sg RN A寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且序列正确;其中靶向ExonⅠ的313#位点的sg RNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因,T7 EⅠ检测其敲除效率高达26.5%,并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34+细胞和正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT-PCR检测脐血CD34+细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34+细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNC不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论:HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXB4在CD34+细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。

HOXB4、PRDM16及HOXA9在急性髓系白血病中的表达及临床意义

目的:检测HOXB4、PRDM16及HOXA9在急性髓系白血病(AML)患者骨髓中的表达水平,探讨其临床意义。方法:采用实时荧光定量PCR方法,检测40例初治或复发AML患者、9例完全缓解患者和19例对照者(非恶性血液病患者及健康供者)骨髓细胞HOXB4、PRDM16及HOXA9 mRNA表达水平,分析其与疾病特征、临床疗效之间关系。结果:初治或复发AML患者骨髓细胞中HOXB4、PRDM16和HOXA9表达水平均明显高于非恶性血液病患者(P<0.05);初治或复发AML患者HOXB4基因表达水平与骨髓白血病细胞比例成正相关(r=0.39),HOXB4、PRDM16和HOXA9基因的表达水平两两之间具有相关性;AML不同病程阶段(初诊、复发、缓解)HOXB4、PRDM16基因表达水平差异具有统计学意义;按预后危险度分层将初治及复发AML患者分为高、中、低危3组,3组之间HOXB4、PRDM16、HOXA9表达水平的差异无统计学意义;经2个疗程正规化疗,缓解组(CR/PR)患者治疗前的3个基因表达水平均低于未缓解组治疗前水平(P<0.05);上述3个基因低表达组缓解率均高于高表达组(P<0.05)。结论:HOXB4、PRDM16、HOXA9基因表达水平与AML患者肿瘤负荷、疗效和预后存在一定的关系。在初治和复发的AML患者骨髓细胞高表达,缓解后其表达水平下降,表达高者化疗效果差,缓解率低。

HOXB4转录因子在造血干细胞中表达调控机制的研究进展

作为同源盒基因(homeobox gene,hox)家族成员,HOXB4编码一类同源盒DNA依赖的结构域核蛋白,是一类特异性的转录因子,对造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)自我更新及分化之间的平衡起着重要的调节作用。为此,hoxB4在HSC中的表达调控机制备受关注。相关研究证明,hoxB4的一些上游调控因子,如上游激活因子-1(USF-1)、上游激活因子-2(USF-2)和核因子Y(NF-Y),以及一些造血细胞因子如血小板生成因子(TPO)及Wnt3a信号蛋白等,对hoxB4在HSC中的表达均起着重要调控作用。本文就hoxB4基因的结构、生物学特点及其在HSC中表达的调控机制作一综述。

经人类巨细胞病毒感染的人脐血造血干细胞向淋巴系造血祖细胞增殖分化过程中同源盒b4、b6基因的表达

目的探讨经人类巨细胞病毒(HCMV)感染的人脐血造血干细胞(HSC)向淋巴系造血祖细胞(CFU-TL)增殖分化过程中同源盒(hox)b4、b6基因的表达。方法取健康母亲健康足月顺产儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血祖细胞体外培养技术,分组以HCMV-AD169病毒液和(或)全反式维A酸(ATRA)持续干预,观察其不同时间点各组细胞集落生成情况,并在鉴定为CFU-TL集落细胞后不同时间点分别提取各组细胞核糖核酸(RNA)并检测其完整性;将提取到的总RNA反转录为互补脱氧核糖核酸,在不同时间点采用实时荧光定量反转录PCR(FQ-RT-PCR)技术检测各组hoxb4、hoxb6基因的表达。结果1.培养的集落细胞经瑞-姬染色法染色,鉴定为CFU-TL。2.各组所提取的RNA结构基本完整。3.人脐血HSC向CFU-TL增殖分化过程中(体外),各组hoxb4、hoxb6基因均有表达,且随培养时间推移,hoxb4基因表达的相对水平逐渐降低;而hoxb6基因表达的相对水平在培养第7天最高,第12天降低。4.与空白对照组比较,ATRA组的hoxb4、hoxb6基因表达的相对水平显著增高,而HCMV组的hoxb4、hoxb6基因表达的相对水平较低。5.与HCMV组比较,HCMV加ATRA组的hoxb4、hoxb6基因表达的相对水平较高。结论1.hoxb4、hoxb6基因在人脐血HSC向CFU-TL增殖分化过程中(体外)均有表达,提示其均与淋巴系统造血密切相关。2.HCMV能下调CFU-TLhoxb4、hoxb6基因的表达(体外),提示HCMV可能通过调控hoxb4、hoxb6基因表达异常导致造血功能异常。3.ATRA能显著上调正常CFU-TLhoxb4、hoxb6基因的表达。