棉花黄萎病菌对转hpa1_(Xoo)基因棉花幼苗相对电导率的影响

以两个转hpa1x00基因的棉花株系T一33和T一35及其出发品种即非转基因棉品种Z35的2～3叶期棉花幼苗为试材，通过无底塑料盆钵菌液浇根接菌法，在0～10d不同时段测定叶片浸出液电导率。转基因棉T-34在0～10d间相对电导率呈增加趋势，10d时增加率达到115．90％；T一33在接菌后0～1d间的电导率增幅反而略有下降，但3～10d的增幅均呈现上升趋势，到10d时达到140．61％；Z35从接菌后0～10d的电导率增幅均呈现逐渐上升趋势，到10d时相对电导率增加率达到180．78％。转基因棉到达相对电导率峰值的时间晚于非转基因棉，其峰值也低于非转基因棉；同时两个转基因棉花株系相对电导率的增加率均低于非转基因棉。被黄萎病菌感染后转基因棉的显症时间较非转基因棉出现晚，两个转基因株系的受危害程度也低干非转基因棉。

编码harpin_(Xoo)蛋白的基因hpa1_(Xoo)转化菊花增强对蚜虫的抗性

将水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae编码harpinXoo蛋白的hpa1Xoo基因构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpa1Xoo-bar,由根癌农杆菌Agrobacterium tumefa-ciensLBA4404介导,叶盘法转化寒菊QX-077,获得了草丁膦转基因寒菊株系。经PCR、Southernblot和RT-PCR检测证明hpa1Xoo已整合到寒菊基因组中。在转基因株系的叶片和植株上抗虫性鉴定表明,转基因寒菊显著抑制桃蚜Myzus persicae的繁殖(t<0.01)。RT-PCR表明转基因植株中hpa1Xoo能够在转录水平正常表达。hpa1Xoo转化寒菊可以正常表达并提高寒菊对蚜虫的抗性。

转hpa1_(Xoo)基因棉花对棉铃虫全基因组转录谱的影响

【目的】明确转hpa1Xoo棉花抗虫性及其作用机制。【方法】采用生测法和芯片技术分析了转hpa1Xoo棉T-34的抗虫性和harpinXoo表达对棉铃虫全基因组转录谱的影响。【结果】饲喂T-34棉叶的棉铃虫发育明显迟缓,棉铃虫死亡率为90.95%,而饲喂其出发品种(Z35)棉叶的棉铃虫死亡率为12.20%。利用和棉铃虫同属鳞翅目的家蚕的23KOligo探针,以分别饲喂T-34和Z35叶片的棉铃虫RNA为模板,制作了棉铃虫Oligo表达谱芯片,获得了24280个EST数据,从中检测到了2927个基因。在T-34和Z35上饲喂的棉铃虫有872个差异表达基因,其中上调基因328个(ratio>2.0),下调基因544个(ratio<0.5)。872个差异表达基因主要涉及13个生物功能、96个代谢通路。【结论】转hpa1Xoo棉花对棉铃虫的抗性涉及棉铃虫蛋白酶分解和合成、ATP合成等多个生物代谢途径的改变。

2种harpin内源表达对短短芽孢杆菌HAB-5菌株抑制和促生能力的影响

采用化学方法分别将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、棉花角斑病菌(X.citri subsp.malvacearum)hrp基因簇中的hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因转化至生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevs)HAB-5菌株,测定2种harpin蛋白对短短芽孢杆菌抑菌和促生能力的影响,以期获得更高效的生防菌株。结果表明,获得转入hpa1_(Xoo)的突变体581个,转入hpa_(Xm)的突变体有650个;经PCR及PCR Southern Blot验证,确定hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因均成功转化至HAB-5菌株中;经SDS-PAGE电泳,在分子量大小约39、41 ku处可见明显条带,表明hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因分别编码的融合蛋白GST-harpin Xoo、GST-harpin Xm在突变体菌株中得到表达;与出发菌株HAB-5菌株相比,转化后的突变体在菌落形态、拮抗活性上均发生了改变,且突变体总蛋白可在烟草叶片上激发过敏性反应,而HAB-5菌株总蛋白不能激发过敏性反应;突变体菌株对番茄种子的促生作用显著提高,且转入hpa_(Xm)基因的菌株效果更佳,使胚芽、胚根的生长分别提高100.77%、69.14%。可见,harpin能够在短短芽孢杆菌HAB-5菌株中得到表达,且转化后的突变体表现出良好的促生效果。

表达hpa1_(Xoo)基因棉花对黄萎病抗性及农艺性状的影响

黄萎病是棉花生产中最具毁灭性病害之一,种植抗病品种是控制黄萎病害最为有效途径之一。本试验通过花粉管通道法将hpa1Xoo基因导入陆地棉品系854,经多代选育获得了可稳定遗传表达hpa1Xoo基因且农艺性状稳定的2个棉花材料854-3、854-5,具有出苗快、长势较好、整齐度高、植株中等、株型松、茎秆毛少光滑、叶片大、叶色深绿、叶功能较好、结铃性较强、铃形较大、吐絮畅等特点。2013—2014年854-3、854-5株高98.0~114.0 cm,单株果枝15.60~18.10个,单株结铃26.90~48.45个,铃质量5.26~5.92 g,衣分39.54%~45.10%,籽棉产量3 186.45~5 023.65 kg/hm^2,皮棉产量1 437.5~1 998.45 kg/hm^2。854-3、854-5黄萎病指数分别为4.23、2.80,均为高抗水平。854-3、854-5纤维上半部平均长度分别为28.78、28.83 mm,断裂比强度分别为27.9、28.4 c N/tex,马克隆值分别为5.67、5.83,伸长率分别为6.3%、6.2%。854-3、854-5纤维外观色泽洁白,手感有弹性,内在品质优良,可为棉花抗病品种选育提供种质或材料。

水稻白叶枯病菌Hpa1_(Xoo)蛋白的结构分析

在大肠杆菌中表达了水稻白叶枯病菌Jxo III菌株的Hpa1Xoo(harpinXoo)蛋白,通过生物物理和生物化学方法分析了Hpa1Xoo的结构特征。Hpa1Xoo粗蛋白能使烟草产生过敏性坏死反应(HR),以及圆二色(CD)光谱具有α-螺旋的典型特征。通过柱层析纯化发现Hpa1Xoo蛋白存在2种洗脱峰组分A和B,B组分的含量远高于A组分,且二组分都具有HR活性。空间排阻色谱(SEC)和分析超速离心(AUC)结构分析表明组分A是Hpa1Xoo的二聚体形式,而组分B是Hpa1Xoo的单体形式。组分A与B均具有α-螺旋的特征CD谱,但存在含量和构象上的差异。生物信息学方法对Hpa1Xoo二级结构和聚体结构的预测结果与实验测定和分析拟合的结果相一致。另外,预测也发现Hpa1Xoo存在丰富的固有无序结构区域。