高效银耳芽孢遗传转化体系的建立

【目的】建立PEG介导的高效银耳(Tremella fuciformis)芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1(含有构巢曲霉gpd-An启动子和潮霉素抗性基因hph)和pLg-hph(含香菇gpd-Le启动子和hph基因)转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50μg·ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100μg·ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进银耳芽孢的基因组中,其转化率为110个/μgDNA。而pAN7-1转化子经过PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明只有部分转化子基因组中整合了hph基因,其转化率只有9个/μgDNA。银耳芽孢转化子在PDSA培养基中继代5次后仍检测到hph基因的存在,表明外源基因hph能在银耳芽孢继代中稳定遗传。【结论】25%的PEG4000能高效介导银耳原生质体的转化;香菇gpd-Le启动子是银耳芽孢表达外源hph基因的强启动子;外源hph基因能够在银耳芽孢继代培养中稳定遗传。

高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,EHA105菌株)介导法,对平菇(Pleurotus ostreatus)菌丝体遗传转化的最佳试验条件进行研究,结果表明:当平菇菌丝体与甘露醇和山梨醇的混合液预处理20min,且与农杆菌共培养60min时,转化效率高且用时较少。经PCR和Southern Blotting检测表明,转移DNA(transferred DNA,T-DNA)中的潮霉素抗性基因hph已整合到转化子基因组中。

绿色荧光蛋白和潮霉素抗性双标记载体转化草酸青霉菌P8的研究

草酸青霉菌P8(Penicillium oxalicum)溶磷菌株具有较强的溶解多种无机难溶磷的能力和促进作物生长的作用。为研究P8在作物根际的定殖状况,用携带加强型绿色荧光蛋白和潮霉素抗性的双标记载体转化溶磷青霉菌P8的原生质体,筛选出稳定、高效表达GFP并对潮霉素产生抗性的转化菌株,Southern杂交分析结果显示,外源质粒DNA是以非同源重组方式整合到转化菌株基因组染色体上。试验证明转化菌株的形态学特征和溶磷能力与野生型菌株无明显差别。

PEG介导的苹果腐烂病菌原生质体转化

【目的】建立PEG介导的苹果腐烂病菌原生质体遗传转化体系。【方法】本文利用带有hph基因的质粒,以苹果腐烂病菌(Valsa mali var.mali)03-8为受体菌株,通过PEG融合法对其原生体进行转化。【结果】于YEPD内培养48 h的菌丝,在酶解液浓度为50 mg/mL Driselase+10 mg/mL Lysing Enzymes情况下,按10 mL酶液/0.5 g湿菌体比例,酶解2 h时可以释放出4×107个/mL原生质体,其转化效率为44个/μg DNA。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析表明,hph基因已经整合进苹果树腐烂病菌的基因组中。转化子在PDA培养基中继代5次后,87.5%的转化子仍能正常生长,表明外源基因hph能在苹果树腐烂病菌中稳定遗传。【结论】该转化体系的建立为苹果树腐烂病菌致病相关基因的深入研究奠定了基础。

银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立

银耳(Tremella fuciformis)属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢.银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点.本研究以gpd-Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pGlg-gfp和pGlq-hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg/mL;采用电击法把pGlq-hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为:STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1.0×108个/mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2.0kV/cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个/μgDNA.采用最佳电击参数把质粒pGlg-gfp和pGlg-hph按1︰1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37.5%.这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达.