构建携带VEGF_(121)-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达(英文)

背景:血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。目的:构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。方法:以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。结果与结论:经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗。

单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu转染内皮祖细胞后移植治疗缺血性股骨头坏死的实验研究

将构建的单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu转染到诱导的兔骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)后移植到股骨头缺血坏死(avascularnecrosis of the femoral head,ANFH)局部,检测其促进坏死区局部成血管和成骨能力。密度梯度离心法获取兔骨髓单个核细胞(mononuclearcells,MNCs),用M199培养基诱导MNCs为EPCs;通过细胞形态、特殊表面标记、摄取能力方面鉴定EPCs;将Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu载体转染到EPCs,再将其移植入ANFH模型局部;分别于术后2周、4周处死模型,行坏死区成血管和成骨指标检测。结果显示:与对照组(B组)和空白组(C组)相比,实验组(A组)有较多新血管生成(P<0.05),B组与C组比较有统计学差异(P<0.05);组织学及BMP-2免疫组化检测,A组与B组和C组之间差异具有统计学意义(P<0.05),B组与C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。综上所述,该实验提示移植转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu的EPCs具有较强的成血管及成骨能力。