大豆黄单胞杆菌基因hrpG的突变及其对致病性影响

大豆细菌性斑疹病是贻害大豆稳产、高产的主要病害之一,其影响遍及全球。该病害的病原之一是革兰氏阴性菌黄单胞杆菌的致病变种Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag)和Xanthomonas campestris pv. glycinea (NaKmo) Dye (Xcg)。革兰氏阴性病原菌大多通过hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion systems, T3SS)将毒力因子注入寄主细胞中,从而导致寄主发病。本研究采用的细菌性斑疹病致病菌Xagneau-001,分离自黑龙江佳木斯大豆主产区,该菌株已经完成全基因组测序。在基因组注释过程中发现其基因组中含有hrp基因家族中的hrpG基因,本课题组针对hrp G基因的致病性开展深入研究。通过三亲杂交的方法成功构建突变体菌株XagΔhrpG,并利用PCR检测结合DNA测序结果证实突变体XagΔhrpG中hrpG基因已成功敲除。将野生型菌株Xagneau001、突变菌株XagΔhrp G共同接种12个遗传背景不同品种的大豆资源,测定突变体XagΔhrpG对大豆的致病力的影响。结果显示大豆接种XagΔhrpG后斑疹病发病时间滞后、进程减缓,发病程度显著降低。统计接菌4 d后单位面积病叶的病原菌数量显示,突变体XagΔhrpG的病原菌数量显著低于野生型Xagneau001。这表明与野生型Xagneau001相比,XagΔhrpG突变体对于大豆的致病力大幅减弱,指示hrpG基因正向调控Xagneau001对大豆致病力。

hrp基因关键调控因子HrpG在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究

水稻自叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xoc)在非寄主烟草上产生过敏反应(HR)和在寄主水稻上具有致病性,是由hrp致病岛决定的,其中HrppG为关键调控因子。Xoo和Xoc侵染水稻途径和在水稻上产生病害症状的不同,是否与hrpG基因有关,还不清楚。本研究利用反向遗传学方法获得了Xoo和Xoc的hrpG突变体:P△hrpG和R△hrpG,并用hrpG_(Xoo)基因和hrpG_(Xoc)基因分别互补上述2个突变体,获得了相应的互补菌株。致病性测定结果显示,P△hrpG和R△hrpG突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主烟草上产生HR的能力,而hrpG_(Xoo)基因和hrpG_(Xoc)基因可分别互补上述突变体至野生型水平。利用GUS报告基因检测基因启动子活性发现,hrpG_(Xoo)和hrpG_(Xoc)的启动子活性没有显著差别;RT-PCR和Western杂交结果显示,hrpG基因交叉互补菌株中HrpG调控的下游基因hrpX、hpaR、hrcT、hpa2和hrpD6的表达没有差异,且Ⅲ型分泌系统分泌蛋白Hpa2的分泌性没有受到影响。这些结果表明,稻黄单胞菌hrpG基因可在Xoo和Xoc中交叉互置,位于其上游和下游的调控途径可能相似,而决定Xoo和Xoc在水稻上的侵染途径以及所致病害症状差异可能与hrpG基因位点无关。

水稻白叶枯病菌hrpG调控基因的鉴定

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻上最严重的细菌病害之一。Xoo与寄主水稻的互作依赖由hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS),将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注射入水稻细胞,引起BLB症状的扩展。HrpG是hrp基因转录表达的主要调控因子。为了鉴定未知的hrpG调控子,本研究在以hrpG∷gusA为报道基因构建的转座子突变体库中,筛选获得4个候选的hrpG负调控子突变体G24-46、G48-22、G19-14和G57-41。GUS活性测定、荧光定量PCR以及烟草组织的GUS染色试验均显示,在这些突变体中hrpG的表达显著增加。Southern杂交结果显示,突变体中转座子均为单一位点的插入。插入位点分析结果显示,在G24-46、G48-22、G57-41和G19-14中转座子分别插入在minD、pilA、metB和wxoB基因中。毒性测定结果显示,这4个突变体在水稻上的毒性显著降低。这些hrpG调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌hrpG上游调控网络提供了新的科学线索。