Hsa-let-7b-5p抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭

目的探讨hsa-let-7b-5p在非小细胞肺癌临床诊断和靶向治疗中的价值。方法收集2020年9月-10月的13对哈尔滨医科大学附属肿瘤医院病理类型相同的非小细胞肺癌癌组织及其癌旁组织,通过RNA-Seq获得差异表达的miRNA,并通过qRT-PCR验证候选miRNA在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达水平。通过CCK-8法、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验验证miRNA对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响。利用MiRDB、TarBase和ENCORI数据库预测靶基因,并利用FunRich工具进行基因富集分析。结果与癌旁组织及正常支气管上皮细胞系(Human bronchial epithelial cell,HBE)相比,hsa-let-7b-5p在非小细胞肺癌组织及非小细胞肺癌细胞系(A549、H1299、H358和H460)中低表达(P<0.05)。hsa-let-7b-5p的高表达可以抑制非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01)。靶基因预测及富集分析结果显示hsa-let-7b-5p的378个靶基因及其相关基因中,147个基因与hsa-let-7b-5p的表达呈负相关(P<0.05)。结论Hsa-let-7b-5p对非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭有抑制作用。

Hsa-let-7诱导肺癌细胞凋亡与G_0/G_1期阻滞及其分子机制

目的:研究hsa-let-7对肺癌细胞功能的影响并探索其机制。方法:构建重组质粒pGenesilTM-let-7a和pGenesilTM-control,经脂质体介导稳定转染人肺鳞癌细胞系KUM-LK2、肺腺癌细胞系A549,小细胞肺癌细胞系H446,经qRT-PCR检测转染后3种肺癌细胞中let-7a的表达差异,Western blot检测let-7a下游基因Ras、ERK的表达差异,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期,探索let-7a通过MAPK信号转导通路影响肺癌细胞的功能及机制。结果:转染pGenesilTM-let-7a后,let-7a在实验组肺癌细胞中的表达显著高于对照组肺癌细胞,Western blot证实p-Ras、p-ERK在实验组细胞中的表达显著低于对照组(P<0.05),而t-Ras及t-ERK的表达差异不显著(P>0.05);同时实验组肺癌细胞的凋亡率显著高于对照组肺癌细胞,实验组肺癌细胞S期比例显著低于对照组,而G0/G1期比例显著高于对照组(P<0.05)。结论:Let-7a通过作用于靶基因Ras,影响ERK的表达,调节MAPK信号转导通路,促进肺癌细胞的凋亡,使G0/G1期肺癌细胞比例增加,可能在肺癌的发生发展中起重要的作用。

退变性腰椎侧凸发病中Hsa-let-7f调控白细胞介素10/STAT3信号通路的作用

背景:microRNAs(miRNAs)在多种疾病中扮演重要的角色,对退变性腰椎侧凸患者椎间盘中miRNAs表达谱的分析,有助于揭示其发病机制,为其治疗提供新的靶点。假设miRNA通过调控白细胞介素10/STAT3(椎间盘退变的一个潜在炎症通路)信号通路促使椎间盘退变。目的:比较退变性腰椎侧凸患者与正常对照组椎间盘组织中miRNAs表达谱的差异,确定退变性腰椎侧凸特异性相关的miRNAs,并对其进行功能验证。方法:对获取的退变性腰椎侧凸患者手术髓核组织和腰椎骨折患者正常髓核组织依次进行总RNA提取,其中,各取10例进行miRNA Solexa测序筛查,挑选表达有差异的microRNA。随后,采用q RT-PCR技术对其进行验证。对表达显著差异的miRNA进行探究。进一步对其进行功能验证,确定其与Ⅱ型胶原表达的关系。运用Western与荧光素酶报告系统进一步确定靶基因。结果与结论:与正常对照相比,30条miRNA表达存在显著差异(16条表达上调和14条表达下调)。随后进行q RT-PCR验证,与正常对照相比,Hsa-let-7f在退变性腰椎侧凸患者椎间盘组织中,表达显著下调。此外,Hsa-let-7f表达水平与椎间盘退变评分密切相关。高表达Hsa-let-7f促进Ⅱ型胶原表达。敲除白细胞介素10后,对Ⅱ型胶原表达表达类似与过表达Hsa-let-7f。生物信息学软件证实,白细胞介素10为Hsa-let-7f理论上的靶基因。荧光素酶报告系统及western blot进一步证实Hsa-let-7f的靶基因为白细胞介素10。此外,Hsa-let-7f影响其下游基因STAT3及基质金属蛋白酶2基因表达。研究表明,下调的Hsa-let-7f通过调控白细胞介素10/STAT3信号通路,导致椎间盘组织中Ⅱ型胶原的丢失,进而引起椎间盘退变及退变性腰椎侧凸;Hsa-let-7f可成为治疗退变性腰椎侧凸的一个新的生物治疗靶点。

宫颈癌细胞中ΔNp63α的MicroRNA表达谱及其对hsa-let-7b-3p的调控机制

目的在宫颈鳞癌细胞中筛选出ΔNp63α显著调控的mi RNAs,并探讨其对宫颈癌细胞功能的影响。方法通过mi RNA芯片技术筛选出ΔNp63α过表达的Si Ha细胞株(Si Ha/p63)中差异明显的mi RNAs,并进行q RT-PCR验证;通过q RT-PCR在沉默ΔNp63α的ME-180细胞株(ME-180/Shp63)中检测差异表达的mi RNAs,并选择差异较显著的hsa-let-7b-3p作为研究对象;向Si Ha细胞中转染hsa-let-7b-3p刺激剂,通过生长曲线、Western blot以及流式细胞仪检测hsa-let-7b-3p对Si Ha细胞增殖及凋亡的影响。结果 (1)在ΔNp63α过表达的Si Ha细胞株中,筛选出10个变化较显著的mi RNAs;(2)在ΔNp63α沉默的ME-180细胞中,筛选出5个与上述变化趋势一致的mi RNAs;(3)hsa-let-7b-3p过表达抑制Si Ha细胞的增殖;(4)hsa-let-7b-3p过表达促进Si Ha细胞的凋亡。结论宫颈癌细胞株中,mi RNA hsalet-7b-3p的表达与ΔNp63α的表达呈正相关,且可以有效抑制细胞增殖,其作用机制可能与诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡相关。

hsa-let-7a-5p调控牙周膜干细胞增殖及凋亡

目的探讨hsa-let-7a-5p对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖及凋亡的影响。方法将let-7a-5p mimics、mimics nc、let-7a-5p inhibitor、inhibitor nc转染进入PDLSCs,通过RT-qPCR测定转染效率,通过CCK-8、细胞周期、EdU实验检测let-7a-5p对PDLSCs增殖的影响,通过细胞凋亡实验检测PDLSCs的凋亡率。结果let-7a-5p成功转染进入PDLSCs。let-7a-5p mimics可抑制PDLSCs增殖能力(P<0.05),促进PDLSCs凋亡(P<0.01)。let-7a-5p inhibitor可促进PDLSCs增殖能力(P<0.05),抑制PDLSCs凋亡(P<0.01)。结论hsa-let-7a-5p可抑制PDLSCs增殖,促进PDLSCs凋亡。

hsa-Let-7a-5p靶向结合TGF-βR1抑制局限性硬皮病成纤维细胞纤维化

目的探讨hsa-Let-7a-5p对局限性硬皮病成纤维细胞(LSFs)纤维化过程的影响及其与转化生长因子-β受体(TGF-βR)和TGF-β/Smad信号通路的关系。方法将携带hsa-Let-7a-5p和shTGF-βR1的慢病毒载体及空白慢病毒载体感染LSFs。CCK-8法和划痕实验检测各组LSFs的增殖和迁移情况。RT-qPCR、免疫荧光和Western blot检测转染的效率以及各组LSFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-βR1、TGF-β、p-Smad2/3的mRNA和蛋白表达水平。结果病毒感染LSFs后,shTGF-βR1组的TGF-βR1表达量明显低于对照组(P<0.05);shTGF-βR1组的细胞增殖率、迁移能力均有所降低;shTGF-βR1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β、p-Smad2/3的mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。生物信息学分析表明hsa-Let-7a-5p可以与TGF-βR13′-UTR的靶区位置配对,hsa-Let-7a-5p慢病毒转染组的hsa-Let-7a-5p表达量明显高于对照组(P<0.05),TGF-βR1表达量明显降低(P<0.05)。hsa-Let-7a-5p组的细胞增殖率、迁移能力均有所降低;hsa-Let-7a-5p组的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β、p-Smad2/3的mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。结论hsa-Let-7a-5p在体外通过靶向结合TGF-βR1调控TGF-β/Smad通路,抑制LSFs增殖与迁移,降低LSFs的纤维化标志物,从而抑制局限性硬皮病的纤维化。

血浆hsa-let-7d-3p在阿尔茨海默病中的诊断价值及功能

目的探索hsa-let-7d-3p在阿尔茨海默病(AD)中的诊断价值和功能。方法收集2018年4月至2022年3月于徐州市第一人民医院就诊的80例AD患者作为AD组,同期招募60名健康者作为健康对照组。筛选GSE46579和GSE120584数据集中AD患者血浆中显著变化的微RNA(miRNA),采集两个数据集中上调及下调的miRNA进行生物标志物的筛选。通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测所筛选的差异miRNA的表达水平。应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)、简易智力状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估基础量表(MoCA_B)评分评价hsa-let-7d-3p对AD的诊断价值。此外,建立Aβ25~35损伤SH-SY5Y的细胞模型,采用RT-qPCR检测hsa-let-7d-3p水平。通过转染使细胞表达hsa-let-7d-3p,使用四唑盐法验证其是否影响Aβ25~35对细胞活力的作用。结果AD组MMSE评分、MoCA_B评分低于健康对照组(P<0.01)。在GSE120584与GSE46579中均上调的miRNA为hsa-miR-5001-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-4435、hsa-miR-3605-3p,均下调的miRNA为hsa-miR-548h-5p、hsa-miR-29c-3p。AD组血浆hsa-miR-5001-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-589-5p水平明显高于健康对照组(1.43±0.37比1.00±0.32,1.60±0.35比1.00±0.30,1.34±0.38比1.00±0.26)(P<0.01),血浆hsa-miR-29c-3p水平明显低于健康对照组(0.58±0.35比1.00±0.29)(P<0.01),两组hsa-miR-4435、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-548h-5p比较差异无统计学意义(P>0.05)。在AD患者血浆中变化最为显著的上调miRNA为hsa-let-7d-3p,hsa-let-7d-3p的ROC曲线下面积为0.910;AD患者血浆hsa-let-7d-3p与MMSE评分呈负相关(r=-0.536,P<0.01),与MoCA_B评分呈负相关(r=-0.617,P<0.01)。与控制组相比,Aβ25~35处理可显著降低SH-SY5Y细胞的活力(P<0.01);与Aβ+mimics NC组相比,Aβ+mimics组SH-SY5Y细胞活力下降(P<0.01),与Aβ+inhibitor NC组相比,Aβ+inhibitor组SH-SY5Y细胞活力升高(P<0.01)。结论AD患者和AD细胞模型中的hsa-let-7d-3p表达均上调,hsa-let-7d-3p在AD中参与病理作用机制,并可作为AD诊断的生物标志物。

hsa-let-7e-5p对肺腺癌细胞迁移的影响

目的筛选肺腺癌中差异表达的环状非编码RNA(miRNA),并分析其对肺腺癌(LUAD)迁移的影响及潜在机制。方法通过miRNA芯片筛选出LUAD组织和正常肺组织中差异表达的miRNA并预测其潜在的生物学功能和信号通路;通过荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和癌症基因组图谱(TCGA)分析验证hsa-let-7e-5p在LUAD组织和细胞系中的表达水平;通过划痕试验检测hsa-let-7e-5p对LUAD细胞迁移的影响;通过生物信息学分析和qRT-PCR验证hsa-let-7e-5p与基因DTX2、NME6、C8orf58、GATM和DHX57之间的靶向关系。结果miRNA芯片结果显示肺腺癌组织中347个miRNA下调而229个miRNA上调。hsa-let-7e-5p在LUAD组织和细胞系中下调,过表达hsa-let-7e-5p可以抑制肺腺癌细胞迁移。结论hsa-let-7e-5p在肺腺癌中低表达并抑制肺腺癌细胞的迁移,DTX2、NME6、C8orf58、GATM和DHX57是hsa-let-7e-5p的潜在靶基因。

Hsa-let-7g调控癌基因HERG1与胃癌发病的关系

目的探讨Hsa-let-7g调控癌基因HERG1参与胃癌的发病机制。方法 RT-PCR和Western blot检测HERG1在胃癌细胞株中的表达;HERG1特异性干扰RNA技术阻断胃癌细胞株SGC-7901细胞中HERG1的表达,以MTT法检测细胞增殖变化;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;构建与Hsa-let-7g绑定结合的HERG1 3′端非编码区域荧光素酶报告基因质粒,检测转录活性以及HERG1表达。结果 HERG1在胃癌细胞中高表达;HERG1特异性干扰RNA阻断后,SGC-7901细胞增殖受到抑制,迁移和侵袭能力下降(P<0.05);转染Hsa-let-7g mimics后,野生型报告基因质粒活性下降,SGC-7901细胞中Hsa-let-7g表达升高时HERG1表达降低,Hsa-let-7g表达降低时HERG1表达升高(P<0.05)。结论 HERG1基因在胃癌细胞中高表达,与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭相关;HERG1表达直接受Hsa-let-7g的调控,是Hsa-let-7g特异性靶基因之一。

三阴性乳腺癌中受c-Myc调节的微小RNA表达谱分析

目的探讨c-Myc调控的微小RNA(miRNA,miR)表达及其在三阴性乳腺癌(TNBC)转移中的作用机制。方法采用慢病毒构建c-Myc低表达的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,分为c-Myc沉默组、阴性对照组和空白对照组,分别对不同MDA-MB-231细胞进行miRNA测序,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证具有显著差异的hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-miR-34c和hsa-miR-98在细胞中的表达,及20例三阴性乳腺癌组织和癌旁组织中c-Myc和hsa-let-7a的表达水平。采用方差分析、Sidak方法比较多组差异分析。结果与对照组比较,c-Myc沉默组中有126个miRNA存在显著差异,其中84个显著上调,42个显著下调。RT-qPCR验证发现与对照组比较(1.007±0.128,1.003±0.084,1.008±0.138,1.013±0.184,1.009±0.148),在c-Myc沉默组中,hsa-miR-34c(0.693±0.167,F=6.825,P<0.05)、hsa-miR-98下调(0.737±0.145,F=5.260,P<0.05),hsa-let-7a(1.474±0.349,F=7.081,P<0.05)、hsa-let-7c(1.630±0.485,F=7.387,P<0.05)、hsa-let-7d上调(2.104±0.636,F=11.370,P<0.05)。结论c-Myc调控let-7a、let-7c、let-7d、miR-34c和miR-98影响三阴性乳腺癌侵袭转移。

特发性癫痫患者外周血差异表达miRNA分析

目的分析特发性癫痫患者外周血差异表达miRNA。方法选取2019年1月至2020年1月在新疆维吾尔自治区人民医院神经内科治疗的特发性癫痫患者12例为病例组,选取同期于新疆维吾尔自治区人民医院门诊进行体检的健康者12例为对照组。采集受试者外周血,采用Illumina HiSeq 2000测序仪进行高通量测序,采用edgeR软件筛选差异表达miRNA,采用qPCR检测差异表达miRNA表达水平。结果共完成24个样本测序。各样本原始序列数据统计分析结果显示,原始序列中碱基的测序质量值>20的碱基占总碱基的百分比为92.56%~97.32%,原始序列中碱基的测序质量值>30的碱基占总碱基的百分比为88.01%~93.50%,碱基G和C的数量总和占总碱基数量的百分比为45.29%~52.09%;各样本样品待分析数据统计分析结果显示,原始序列中碱基的测序质量值>20的碱基占总碱基的百分比为95.87%~98.85%,原始序列中碱基的测序质量值>30的碱基占总碱基的百分比为95.30%~96.85%,碱基G和C的数量总和占总碱基数量的百分比为40.38%~47.58%。共检测出146个差异表达miRNA,与对照组相比,研究组共有98个miRNA表达上调,48个miRNA表达下调;其中差异倍数最大的5个差异表达miRNA分别为hsa-let-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p。扩增曲线分析结果显示,样本均经历了良好的扩增过程。熔解曲线分析结果显示,大多数曲线为单峰。病例组hsa-let-7b-3p、hsa-miR-92a-1-5p表达水平低于对照组,hsa-miR-6810-3p表达水平高于对照组(P<0.05)。结论与健康人相比,特发性癫痫患者外周血共有98个miRNA表达上调,48个miRNA表达下调;其中差异倍数最大的5个差异表达miRNA分别为hsa-let-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p,且可能只有hsa-let-7b-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-6810-3p参与了特发性癫痫的发生发展。