hsa-miR-200c-3p的靶基因预测及生物信息学分析

目的:采用生物信息学方法对hsa-miR-200c-3p进行靶基因预测及功能分析,为进一步研究其在肿瘤中的作用和发生机制提供思路。方法:分析miR-200c-3p在不同物种间的保守性及hsa-miR-200c-3p在不同器官和疾病中的表达情况;miRDB和Target Scan预测hsa-miR-200c-3p靶基因,取其交集,合并已经实验证实的靶基因。采用DAVID 6.8数据库对基因集合进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果:miR-200c-3p序列在物种间高度保守。hsa-miR-200c-3p在膀胱、胃肠道、脑、四肢、肺、前列腺等组织中表达丰度较高;与正常组织相比,在膀胱癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等疾病中表达水平较高。包括已被实验证实的靶基因,共得到79个候选基因,主要参与调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、基因表达、细胞增殖、信号转导等生物学过程,涉及前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌等疾病相关通路,以及PI3K-Akt、Ras等肿瘤相关信号通路。结论:hsa-miR-200c-3p功能广泛,参与人类生命活动和疾病过程,与癌症的发生、发展密切相关。

LncRNA FEZF1-AS1靶向调控miR-200c-3p对人肺成纤维细胞生物学行为的影响

目的探讨FEZ家族锌指1-反义RNA1(LncRNA FEZF1-AS1)靶向调控miR-200c-3p对人肺成纤维细胞HLF生物学行为的影响。方法采用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导HLF向肌成纤维细胞转化,分为空白对照组(Blank组)和造模组(HLF+TGF-β1组),另根据转染质粒不同将细胞分为Blank组、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组。采用Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LncRNA FEZF1-AS1和miR-200c-3p的表达。采用CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力;采用双萤光素酶实验检测FEZF1-AS1与miR-200c-3p的靶向作用关系。结果与Blank组比较,HLF+TGF-β1组α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表达及LncRNA FEZF1-AS1表达水平升高,miR-200c-3p表达水平降低(P<0.05);与TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC组比较,TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1组细胞增殖、迁移、侵袭能力下降,LncRNA FEZF1-AS1表达及α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表达水平降低,miR-200c-3p表达水平升高(P<0.05);FEZF1-AS1与miR-200c-3p基因序列上存在结合位点。结论LncRNA FEZF1-AS1通过抑制miR-200c-3p促进特发性肺间质纤维化的发生、发展。

妊娠期糖尿病视网膜病变患者血清miR-200c-3p、 miR-20b-5p表达水平及检测临床意义

目的:探讨妊娠期糖尿病视网膜病变(DR)患者血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平变化及检测临床意义。方法:选择妊娠期糖尿病孕妇80例(GDM组)和DR孕妇75例(DR组),正常妊娠期女性95例(对照组)。采用qRT-PCR法对受试者血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平进行测定,采用全自动生化分析仪对受试者低密度脂胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)进行测定,采用血糖检测仪对受试者空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 hPG)进行测定。结果:GDM组、DR组患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p值显著高于对照组(均P<0.05);DR组患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p值显著高于GDM组(均P<0.05);随着病情严重程度的增加,DR组患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平显著升高(均P<0.05);预后不良组DR患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p值显著高于预后良好组(均P<0.05);多因素Logistic回归分析显示血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平升高为DR患者发生预后不良的危险因素;ROC曲线结果显示,血清miR-200c-3p、miR-20b-5p、两者联合诊断DR患者不良预后曲线下面积(AUC)为0.927(95%CI:0.843~0.974)、0.848(95%CI:0.746~0.920)、0.985(95%CI:0.924~0.999)。结论:DR患者血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平升高,对DR不良预后具有一定的预测价值。

海七鳃鳗pma-miR-200c-3p对斑马鱼心脏发育的作用研究

为研究海七鳃鳗Petromyzon marinus pma-miR-200c-3p在心脏发育过程中的生物学功能,采用显微注射技术,将pma-miR-200c-3p模拟体注射到斑马鱼Danio rerio胚胎,过表达pma-miR-200c-3p后,使用qRT-PCR及Western blot法检测了一些与心脏发育相关的标志性基因的表达水平,以及BMP/Smad通路重要基因蛋白水平的变化,并利用生物信息学预测、GFP荧光表达分析了pma-miR-200c-3p的生物学作用。结果表明:过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼胚胎中,与心脏发育相关的标志性bmp4、bmp5、smad1、gata5、tbx2b和notch1a基因的表达水平极显著上调(P<0.01),同时BMP/Smad通路中BMP4、Smad1、GATA5蛋白表达水平也明显升高;细胞试验表明,cdx1b基因可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因。研究表明,pma-miR-200c-3p可能通过抑制cdx1b基因的表达,参与BMP/Smad通路以促进心脏发育。

miR-200c-3p靶向FOSL1增加乳腺癌细胞化疗敏感性

化疗耐受是乳腺癌复发转移率居高不下、综合治疗效果难以提高的主要瓶颈。前期研究证实,miR-200c-3p在乳腺癌敏感细胞MCF-7中的表达量显著高于耐药细胞MCF-7/5Fu,提示miR-200c-3p可能参与乳腺癌化疗增敏,但是具体机制不详。生物信息学预测联合双荧光素酶报告基因实验证实,miR-200c-3p靶向调控FOSL1,且在多种肿瘤中miR-200c-3p与FOSL1表达负相关。实时荧光定量PCR技术和Western印迹技术证实,FOSL1在耐药细胞MCF-7/5Fu中的表达量显著高于亲本细胞MCF-7。在MCF-7细胞中,过表达FOSL1能够显著提高该细胞对5-Fu的化疗耐受;在MCF-7/5Fu中,使用siRNA技术沉默FOSL1,将提高该细胞对5-Fu的化疗敏感性。此外,MTT实验还发现,miR-200c-3p抑制剂能够显著上调MCF-7细胞对5-Fu的耐受,但是在此细胞中干扰FOSL1的表达,又可以增加其对5-Fu的化疗敏感性;miR-200c-3p mimics显著增加MCF-7/5Fu细胞的化疗敏感性,上调FOSL1表达后又可逆转miR-200c-3p mimics的化疗增敏作用。总之,miR-200c-3p能够通过靶向FOSL1增加乳腺癌细胞对5-fluorouridine化疗敏感性。

miR-200c-3p靶向CCNE2抑制肾母细胞瘤细胞增殖

目的预测和验证miR-200c-3p的靶基因并探讨其对肾母细胞瘤增殖的抑制作用。方法应用生物信息学软件对miR-200c-3p在肾母细胞瘤中的靶基因进行预测,建立SK-NEP-1及G401的miR-200c-3p过表达及抑制表达的稳定细胞系。实验设未转染组(Blank)、模拟物阴性对照组(mimic NC)、miR-200c-3p模拟物组(miR-200c-3p mimic)、抑制剂阴性对照组(inhibitor NC)及miR-200c-3p抑制剂组(miR-200c-3p inhibitor)。采用RT-PCR及Western blot方法检测CCNE2在SK-NEP-1及G401不同组中的表达水平,荧光素酶报告基因检测miR-200c-3p和CCNE2的靶向关系,细胞计数盒(CCK-8)和软琼脂克隆形成实验检测miR-200c-3p对SK-NEP-1及G401细胞增殖的抑制作用。结果生物信息学方法预测CCNE2为miR-200c-3p的靶基因之一。RT-PCR实验结果示肾母细胞瘤细胞中miR-200c-3p模拟物组的CCNE2的表达水平低于模拟物阴性对照组(P<0.05);荧光素酶报告基因检测证实CCNE2是miR-200c-3p的靶基因(P<0.01)。Western blot示在肾母细胞瘤细胞中miR-200c-3p模拟物组的CCNE2蛋白的表达水平低于模拟物阴性对照组(P<0.05);CCK-8和软琼脂克隆形成实验证实miR-200c-3p对肾母细胞瘤细胞的增殖能力有明显抑制作用(P<0.01);而miR-200c-3p抑制剂组结果相反。结论miR-200c-3p通过靶基因CCNE2抑制肾母细胞瘤细胞的增殖。

血清miR-200c-3p、CA125与组织Id1联合检测对卵巢癌早期筛查和诊断的临床价值

目的探讨血清微小RNA-200c-3p(miR-200c-3p)、糖类抗原125(CA125)与组织分化抑制因子1(Id1)联合检测在卵巢癌早期筛查和诊断中的临床价值。方法将南京医科大学附属妇产医院2016年1月至2020年12月就诊的卵巢疾病患者128例分为卵巢良性肿瘤组40例和卵巢恶性肿瘤组78例,选择同期健康卵巢为对照组(40例)。分别采用实时荧光定量PCR和电化学发光法检测血清miR-200c-3p和CA125水平,免疫印迹法检测组织Id1水平。Pearson相关法分析卵巢癌患者血清miR-200c-3p、组织Id1水平与血清CA125水平的相关性。应用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-200c-3p、Id1及CA125水平诊断卵巢癌的价值。结果恶性肿瘤组的血清miR-200c-3p、CA125和组织Id1水平均高于良性肿瘤组和对照组(P<0.05);相关分析显示,卵巢癌患者的血清miR-200c-3p和组织Id1水平与血清CA125水平均呈正相关(r=0.734、0.707,P<0.05)。卵巢癌患者的血清miR-200c-3p、CA125和组织Id1水平与FIGO分期、分化程度、淋巴结转移和恶性腹水有关(P<0.05)。ROC曲线显示,血清miR-200c-3p、CA125和组织Id1水平三项联合诊断卵巢癌的曲线下面积(0.871,95%CI:0.812~0.922)最大,其敏感度、特异度和诊断效率分别为87.1%、88.5%和88.0%。结论血清miR-200c-3p、CA125与组织Id1联合检测能够显著提高卵巢癌早期筛查和诊断的效率,对于卵巢癌的临床早期筛查和诊断具有重要价值。

宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达及其意义

目的探讨宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达水平及其对宫颈癌的辅助诊断价值。方法收集55例宫颈癌患者、32例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者、39例子宫肌瘤患者及47例健康对照者血清样本,分别测定hsa-miR-200a-3p的表达水平及糖链抗原125(CA125)和人鳞状细胞癌相关抗原(SCCAg)水平。分析血清hsa-miR-200a-3p的表达水平与临床病理特征、CA125和SCCAg之间的关系。用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价3项指标单独及联合检测对宫颈癌的辅助诊断价值。结果宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量均高于子宫肌瘤患者和健康对照者,差异有统计学意义(P<0.001)。CIN患者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量均高于子宫肌瘤患者和健康对照者,差异有统计学意义(P<0.05)。子宫肌瘤患者和健康对照者血清hsa-miR-200a-3p的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p的表达水平在年龄大小、是否绝经、肿瘤最大直径、FIGO分期间差异均无统计学意义(P>0.05),宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p相对表达量与CA125(r2=0.012,P=0.421)、SCCAg(r2=0.004,P=0.647)无相关性。ROC曲线分析血清has-miR-200a-3p检测对宫颈癌患者的辅助诊断价值,宫颈癌区分于子宫肌瘤时,ROC曲线下面积(AUC)为0.753;宫颈癌患者区分于健康对照者时,AUC为0.771。结论宫颈癌患者血清hsa-miR-200a-3p相对表达量高于子宫肌瘤组和健康对照组,有可能成为宫颈癌辅助诊断的重要生物学指标。血清hsa-miR-200a-3p的表达水平或可用于CIN的辅助诊断。

CircRNA_000809通过miR-200c-3p对子宫内膜异位症间质细胞的增殖、迁移及上皮间质转化的影响

目的:探讨circRNA_000809通过靶向miR-200c-3p调控子宫内膜异位症间质细胞增殖、迁移及上皮-间质转化(EMT)的作用。方法:收集2020年1月至2022年1月于温州医科大学附属第二医院育英儿童医院行卵巢囊肿剥除术患者的卵巢巧克力囊肿组织25例,设为子宫内膜异位症组;收集25例正常子宫内膜组织,标本来自于因早期宫颈癌行子宫切除术或者行宫腔镜检查术的育龄期非子宫内膜异位症患者,设为正常子宫内膜组。采用qRT-PCR法检测正常子宫内膜、异位内膜组织中circRNA_000809、miR-200c-3p的表达量;分别采用EdU实验和Transwell实验检测异位子宫内膜间质细胞的增殖及迁移;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测相关蛋白表达水平。结果:与正常子宫内膜组织比,异位子宫内膜中circRNA_000809表达上调(P<0.05),而miR-200c-3p的表达下调(P<0.05);且Pearson相关性分析显示在异位子宫内膜组织中circRNA_000809与miR-200c-3p的表达量呈负相关(P<0.05);分别用siNC+inhibitor NC、sicircRNA_000809+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3p inhibitor共转染异位子宫内膜间质细胞,结果显示与siNC+inhibitor NC组比,si-circRNA_000809+inhibitor NC组异位子宫内膜间质细胞增殖和迁移能力减弱,ZEB1/ZEB2的蛋白水平也降低(P<0.05);而si-circRNA_000809+miR-200c-3p inhibitor组异位子宫内膜间质细胞增殖、迁移能力及ZEB1/ZEB2蛋白的表达较si-circRNA_000809+inhibitor NC组均有上升,但较siNC+inhibitor NC组下降(P<0.05)。结论:抑制circRNA_000809表达可通过上调miR-200c-3p的表达从而抑制子宫内膜异位症间质细胞的迁移及EMT。

miRNA-200c-3p在急性呼吸窘迫综合征中的表达及临床意义

目的探讨miRNA-200c-3p在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的表达水平及其临床意义。方法选择2017年7月至2020年7月延安大学附属医院东关分院重症监护室收治的118例ARDS患者作为病例组,选取同期在我院体检的118例健康者作为健康组,检测并比较两组受检者血液中miRNA-200c-3p的表达水平,通过单因素和多因素分析影响急性呼吸窘迫综合征预后的相关危险因素,运用χ^(2)检验分析miRNA-200c-3p与临床指标的关系,运用单因素和多因素COX回归以及ROC曲线,分析miRNA-200c-3p在判断急性呼吸窘迫综合征预后中的价值。运用Pearson相关分析研究miRNA-200c-3p和氧合指数(OI)水平之间的相关性。结果病例组患者血液中的miRNA-200c-3p相对表达量为8.17±1.17,明显高于健康组的3.22±0.89,差异有统计学意义(P<0.05);单因素和多因素COX回归分析结果显示,除年龄、ARDS分级和肺泡动脉氧分压差[P(A-a)O_(2)]外,miRNA-200c-3p也是影响ARDS预后的独立危险因素(P<0.05);miRNA-200c-3p表达与年龄、ARDS分型和P(A-a)O_(2)有关,其中年龄>60岁、ARDS分型越严重和P(A-a)O_(2)>183.5 mmHg显示miRNA-200c-3p的表达更高;根据ARDS患者预后情况,使用ROC曲线分析判断miRNA-200c-3p对预后的价值,结果显示,miRNA-200c-3p的ROC曲线下面积(AUC)为0.847(95%CI:0.769~0.907),特异性为86.29%,敏感性为83.63%;经Pearson相关分析结果显示,miRNA-200c-3p和OI水平存在明显负相关(r=-0.753,P<0.01)。结论miRNA-200c-3p是影响ARDS预后的独立危险因素,监测miRNA-200c-3p在一定程度上可以评估患者病情严重程度和预测患者预后,有助于临床对ARDS患者治疗方案制定。

血清miR-200c-3p表达水平对判断新生儿呼吸窘迫综合征严重程度和预后的价值

目的探讨血清miR-200c-3p表达水平对判断新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)严重程度和预后的价值。方法选取2016年6月-2019年6月收治的102例NRDS新生儿,应用新生儿急性生理学评分围生期补充II(SNAPPE-II)评分进行评估。根据患儿生存情况分为生存组(n=73)和死亡组(n=29),按照X线结果和病情严重程度分为轻度组(Ⅰ、Ⅱ级,67例)和重度组(Ⅲ、Ⅳ级,35例),采用实时荧光定量PCR检测各组血清miR-200c-3p表达水平。应用ROC曲线分析miR-200c-3p表达水平及SNAPPE-II评分预测NRDS患儿死亡的价值。结果死亡组血清miR-200c-3p表达水平及SNAPPE-II评分均明显高于生存组,重度组miR-200c-3p表达水平、SNAPPE-II评分及病死率高于轻度组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清miR-200c-3p表达水平联合SNAPPE-II评分预测NRDS死亡的曲线下面积(AUC)为0.93(95%CI:0.87~0.98),明显高于单项miR-200c-3p(0.84,95%CI:0.78~0.90)及SNAPPE-II评分(0.80,95%CI:0.75~0.86),差异有统计学意义(P<0.05),其灵敏度和特异度为94.0%和88.5%。NRDS患儿血清miR-200c-3p表达水平与SNAPPE-II评分呈显著正相关(r=0.84,P<0.01)。结论血清miR-200c-3p表达水平升高与NRDS病情严重程度及预后相关,miR-200c-3p联合SNAPPE-II评分对NRDS预后判断具有较高价值。

血清HMGB1 miR-200c-3p及cTnⅠ水平对新生儿呼吸窘迫综合征预后的预测价值

目的:探究血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平对新生儿呼吸窘迫综合征预后的预测价值。方法:选取2016年1月至2019年12月本院收治的NRDS患儿120例,根据患者病情分为轻度组(胸片结果为Ⅰ、Ⅱ级)、重度组(胸片结果为Ⅲ、Ⅳ级),各72、48例。另选取同期本院产科出生正常新生儿40例为对照组。对比三组血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平差异,并进行预后预测。结果:三组血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平重度组>轻度组>对照组(P<0.05)。住院期间,120例NRDS患者共34例(28.33%)死亡,86例(71.67%)存活。两组患者的年龄、性别、出生体重、母亲年龄、剖宫产、出现呼吸困难时间、母亲糖尿病、母亲高血压、胎粪吸入、宫内窘迫、新生儿窒息、等相比较均无明显差异(P>0.05),但两组在病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平的差异间具有统计学意义(P<0.05),ROC曲线分析显示,HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平对NRDS患者的预测的AUC为0.933、0.892、0.766,具有较高准确性;以ROC曲线靠左上方约登指数的最大切点作为最佳临界值,该点预测,HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平敏感度、特异度:为91.2%82.4%/50.0%、91.9%/100.0%100.0%,预测具有较高价值。三项联合预测AUC为0.925,敏感度、特异度为85.3%、98.8%,预测价值较高。结论:血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平在NRDS患儿中呈高表达,且与病情程度相关密切,具有较高的预后预测评估价值。

miR 200c-3p CXCR6与乳腺癌患者总生存期无病生存期的相关性研究

目的探讨miR 200c-3p、CXCR6与乳腺癌患者的总生存期、无病生存期的关系。方法选取2013-2015年在我院接受放化疗的乳腺癌患者120例(三阴VS非三阴乳腺癌各60例),获取该120患者的临床病理资料及术后组织石蜡切片,通过固定组织RNA提取试剂盒提取乳腺癌石蜡组织切片中的总RNA,再通过All-inOneTM miRNA定量PCR检测试剂盒检测乳腺癌石蜡组中miR 200c-3p的表达,同时应用免疫组化方法检测肿瘤组织中CXCR6的表达,根据miR-200c-3p及CXCR6不同的表达情况将120例乳腺癌患者分为4组,分析四组患者的生存情况,并分析miR 200c-3p及CXCR6表达高低与乳腺癌患者生存期的关系。结果miR-200c-3p低表达患者与高表达患者的总生存期(P=0.428)及无病生存期(P=0.542)均无差异;CXCR6高表达患者的总生存期差于低表达患者(P=0.006),CXCR6高表达组的无病生存期差于低表达组(P=0.042);四组患者的总生存期存在差异(P=0.022),无病生存期无差异(P=0.160)。两两比较显示CXCR6高表达miR-200c-3p高表达组的总生存期短于CXCR6低表达miR-200c-3p高表达组及CXCR6低表达miR-200c-3p低表达组,P值分别为0.002、0.001。结论乳腺癌患者miR 200c-3p表达与预后无明显关系,CXCR6表达高低与总生存期及无病生存期相关。

miR-200c-3p通过靶向Zeb1调控骨关节炎小鼠模型中软骨细胞凋亡和炎症反应

目的研究miR-200c-3p在骨关节炎(OA)中的作用及其下游的分子机制。方法通过破坏内侧半月板的稳定性构建骨关节炎小鼠模型,采用脂多糖(LPS)处理小鼠原代软骨细胞构建骨关节炎细胞模型。采用RT-qPCR检测骨关节炎小鼠模型样本以及对照组小鼠样本中miR-200c-3p的表达水平。采用RT-qPCR检测LPS处理前后小鼠原代软骨细胞中miR-200c-3p和Zeb1的表达水平变化。CCK-8实验检测miR-200c-3p过表达对骨关节炎细胞模型增殖能力的影响;流式细胞术检测miR-200c-3p过表达对骨关节炎细胞模型凋亡水平的影响;酶联免疫吸附试验检测miR-200c-3p过表达对骨关节炎细胞模型中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)含量的影响。生物信息学分析RNA pull down实验和荧光素酶报告实验验证miR-200c-3p和下游靶基因相互作用。功能拯救实验验证Zeb1对miR-200c-3p作用的影响。结果miR-200c-3p在OA小鼠关节软骨组织和LPS处理的软骨细胞中显著下调。Zeb1在LPS处理的软骨细胞中显著上调。miR-200c-3p上调显著抑制了脂多糖诱导的软骨细胞凋亡和炎症损伤。Zeb1是miR-200c-3p的下游靶基因。Zeb1过表达逆转miR-200c-3p过表达对骨关节炎小鼠模型中软骨细胞凋亡和炎症反应的影响。结论miR-200c-3p通过靶向Zeb1抑制骨关节炎小鼠模型中软骨细胞凋亡并且缓解炎症反应,有助于发现骨关节炎治疗的有效靶点。

miR-200c-3p靶向XIAP调控缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨miR-200c-3p对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法构建缺氧复氧(H/R)H9c2细胞。运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-200c-3p、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)信使核糖核酸(mRNA)的表达。将H9c2细胞分为H/R+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p组(转染anti-miR-200c-3p)、H/R+pcDNA组(转染pcDNA)、H/R+pcDNA-XIAP组(转染pcDNA-XIAP)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-NC组(共转染anti-miR-200c-3p和si-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-XIAP组(共转染anti-miR-200c-3p和si-XIAP),用脂质体法转染至H9c2细胞,再进行缺氧复氧处理。免疫印迹(Western blot)、噻唑蓝(MTT)、流式细胞术检测细胞中XIAP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2 X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)的表达、细胞增殖、细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-200c-3p与XIAP的结合力。结果成功构建缺氧复氧H9c2细胞;与正常培养的H9c2细胞比较,H/R组H9c2细胞中miR-200c-3p表达明显上调,XIAP表达明显下调;抑制miR-200c-3p、过表达XIAP均可抑制H/R H9c2细胞的凋亡,下调cleaved Caspase-3、Bax,上调Bcl-2;miR-200c-3p可显著抑制XIAP 3′UTR野生型报告基因活性,并负向调控XIAP的表达;敲减XIAP可逆转抑制miR-200c-3p对H/R H9c2细胞的凋亡抑制作用。结论miR-200c-3p可诱导缺氧复氧心肌细胞的凋亡,其机制与靶向XIAP有关,可为心血管疾病的治疗提供新靶点。

胃腺癌患者血浆中miR-199a-5p和miR-200c-3p的表达及其诊断和预后判断的价值

目的探讨胃腺癌病人血浆中miR-199a-5p、miR-200c-3p的表达及其诊断和预后判断的价值。方法选取2014年5月至2015年4月胃腺癌病人50例为观察组,同期入选体检健康者50例为研究对照,应用实时荧光定量PCR技术检测两组研究对照血浆中的miR-199a-5p和miR-200c-3p的表达水平情况;比较不同分化程度、淋巴结转移情况的胃腺癌病人的血浆中miR-199a-5p、miR-200c-3p表达水平。结果观察组的miR-199a-5p表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组的miR-200c-3p表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同分化程度、淋巴结转移情况的胃腺癌病人的血浆miR-199a-5p、miR-200c-3p表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃腺癌病人血浆miR-199a-5p、miR-200c-3p表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移情况密切相关,可用于评估胃腺癌的病情严重程度及预后。

lncRNA CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:分析长链非编码(long non-coding RNA,lncRNA)CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与患者临床病理特征的关系,探究CTD-2182N23.1通过靶向miR-200c-3p对甲状腺乳头状癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:采用TCGA数据库分析CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其与患者临床分期、预后的关系。收集2019年05月至2022年03月本院手术切除的50例甲状腺乳头状癌患者癌组织和癌旁组织,采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测甲状腺乳头状癌组织中CTD-2182N23.1的表达,分析其与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征的关系。qPCR检测人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1和人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1、MDA-T32、TT、SW579、B-CPAP中CTD-2182N23.1的表达。体外培养MDA-T32细胞,实验分为NC组和CTD-2182N23.1组。细胞克隆形成实验和Transwell实验分别检测转染后MDA-T32细胞增殖能力和侵袭能力。双荧光素酶基因报告实验验证CTD-2182N23.1与miR-200c-3p之间的靶向关系。qPCR检测转染后MDA-T32细胞中miR-200c-3p和ATP2A2 mRNA的表达。采用TCGA数据库分析CTD-2182N23.1与ATP2A2 mRNA表达的相关性。Western blot法分别检测ATP2A2、CDK1、Cyclin B、Twist、Slug蛋白水平。结果:TCGA数据库显示甲状腺乳头状癌组织中CTD-2182N23.1呈低表达(P<0.01),其与患者临床分期、无病生存期均呈正相关(均P<0.05)。qPCR显示甲状腺乳头状癌组织和细胞系中CTD-2182N23.1均呈低表达(均P<0.05)。CTD-2182N23.1表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移有关联(均P<0.01)。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞克隆形成数目和细胞侵袭数目均明显减少(均P<0.01)。CTD-2182N23.1能够靶向且负调控miR-200c-3p的表达(P<0.01)。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞中ATP2A2基因表达显著升高(P<0.01)。CTD-2182N23.1与ATP2A2 mRNA表达呈正相关。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞中CDK1、Cyclin B、Twist、Slug蛋白水平均显著降低(均P<0.01)。结论:CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中呈低表达,上调CTD-2182N23.1通过调控miR-200c-3p/ATP2A2表达显著抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭,CTD-2182N23.1可能是甲状腺乳头状癌治疗的潜在分子靶标。

长链非编码RNA生长阻滞特异转录物5／微小RNA 200c-3p／血管紧张素转换酶2信号轴参与呼吸窘迫综合征人肺上皮细胞A549的凋亡

目的探究长链非编码RNA生长阻滞特异转录物5／微小RNA200e-3p／血管紧张素转换酶2（1ncRNAGAS5／miR-200c-3p／ACE2）信号轴是否参与呼吸窘迫综合征（ARDS）肺上皮细胞的凋亡。方法构建ARDS大鼠模型，实验分为对照组（Control组）、LPS处理组（ARDS组）、LPS＋pcDNA处理组（ARDS＋pcDNA组）和LPS＋pcDNA-GAS5处理组（ARDS＋pcDNA-GAS5组）。ARDS大鼠构建6h后收集4组大鼠动脉血及肺组织，血气分析仪进行测定氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2），并观察GAS5的表达变化。随后，用LPS处理人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549，分为未处理、LPS、LPS＋pcDNA、LPS＋pcDNA-GAS5、LPS＋pcDNA-GAS5＋pre-NC和LPS＋pcDNA-GAS5＋miR-200c．3pmimic组。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测lncRNAGAS5、ACE2和miR-200c-3p的表达水平；RNA免疫沉淀和RNA下拉（pull-down）实验用于检测GAS5与miR．200c-3p的结合与调控：Westernblotting法检测ACE2的蛋白表达；流式细胞术用于检测A549细胞的凋亡。组间数据比较采用t检验。结果ARDS大鼠实验表明与ARDS＋pcDNA组相比，ARDS＋pcDNA-GAS5组P0，值显著升高[（81．5±3．3）比（57．5±5．1）mmHg，t=4．850，P〈0．05]，PC02值显著降低[（50．6±1．9）比（64．0±1．9）mmHg，t=5．940，P〈0．05]。细胞实验中，与Control组相比，LPS组A549细胞中IncRNAGAS5的表达显著下降（0．43±0．01比1．01±0．01，t=0．242，P〈0．05）。与LPS＋pcDNA组相比，LPS＋pcDNA-GAS5组ACE2的表达水平显著升高（0．85±0．04比0．34±0．02，t=1．800，P〈0．05）：与LPS＋pcDNA-GAS5＋pre-NC组相比，LPS＋pcDNA-GAS5＋miR-200c-3pmimic组ACE2的表达水平显著降低（0．62±0．01比0．84±0．02，t=9．440，P〈0．05）。与未处理组相比，LPS组A549细胞凋亡百分比明显升高（25．90±0．61比7．90±0．22，t=0．257，P〈0．05）；与LPS＋pcDNA组相比，LPS＋pcDNA-GAS5组凋亡百分比明显降低（10．50±0．37比26．37±0．45，t=1．760，P〈0．05）；与LPS＋pcDNA-GAS5＋pre-NC组相比，LPS＋pcDNA-GAS5＋miR-200c-3pmimic组细胞凋亡百分比显著升高（19．07±0．56比10．87±0．26，t=0．643，P〈0．05）。结论ARDS模型中，lncRNAGAS5下调促进miR-200c-3p表达，使ACE2表达下降，从而使肺上皮细胞凋亡增加，促进ARDS进展。

miR-200c-3p对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨miR-200c-3p对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞株增殖与凋亡的调控作用。方法收集2015年1月至2019年8月深圳市儿童医院收治肾母细胞瘤患儿新鲜的瘤组织和瘤旁肾组织30例。实验分为模拟物阴性对照组、miR-200c-3p组及miR-200c-3p抑制剂组。采用实时荧光定量PCR法检测30例配对的肾母细胞瘤肿瘤组织、瘤旁肾组织及肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞和人胚肾293FT细胞系中miR-200c-3p的表达情况。采用细胞计数盒8(CCK-8)细胞增殖实验测定miR-200c-3p抑制SK-NEP-1细胞增殖的效果,流式细胞术检测miR-200c-3p对SK-NEP-1细胞周期及凋亡的影响。裸鼠原位移植实验检测miR-200c-3p过表达对体内成瘤的影响,对瘤体组织进行HE染色并病理形态的观察、免疫组织化学染色检测移植瘤组织中核增殖指数Ki-67的增殖情况;Western blot法检测3组裸鼠移植瘤组织中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3)的表达水平。结果30例患儿miR-200c-3p的表达水平在肾母细胞瘤组织(0.420±0.587)中明显低于配对的瘤旁肾组织(1.500±0.504)(t=8.613,P<0.001)。miR-200c-3p的表达水平在SK-NEP-1细胞中(0.363±0.006)与人胚肾293FT细胞(0.807±0.186)比较也显著下降(t=4.136,P<0.05)。CCK-8法表明按照组间和时间交互效应miR-200c-3p可抑制SK-NEP-1细胞体外增殖(F=16.81,P<0.001)。流式细胞术检测肾母细胞瘤细胞周期与凋亡显示,miR-200c-3p能使SK-NEP-1细胞阻滞在G0/G1期及S期(t=-7.770,P<0.01;t=11.501,P<0.001),且促进早期凋亡率增加,晚期凋亡率降低(t=-22.270,P<0.001;t=4.612,P<0.01)。裸鼠原位移植实验显示与模拟物阴性对照组比较,miR-200c-3p组肿瘤体积[(2.469±0.914)cm^3比(0.419±0.16)cm^3]明显缩小(t=5.407,P<0.001),而miR-200c-3p抑制剂组[(1.627±0.189)cm^3]差异不明显(t=2.209,P=0.052)。Western blot实验示miR-200c-3p上调了凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax的表达水平(t=-47.000、-82.730,均P<0.001),但下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(t=53.740,P<0.001)。结论miR-200c-3p能抑制SK-NEP-1细胞增殖及促进细胞凋亡,抑制裸鼠移植瘤的生长并起到抑癌基因的作用。

miR-200C-3p靶向调控ZEB2抑制前列腺癌细胞增殖和迁移的实验研究

目的前列腺癌的进展与多种因素有关,本研究旨在探索miR-200C-3p对前列腺癌细胞系的影响,并分析miR-200C-3p与ZEB2的潜在机制。方法通过qRT-PCR检测miR-200C-3p在前列腺癌细胞系PC-3、DU145、前列腺上皮细胞RWPE-1的表达量。DU145转染miR-200C-3p后,通过CCK-8、划痕修复实验以及Transwell实验探究增殖与迁移能力。沉默ZEB2后分析DU145增殖和迁移能力的变化,采用双荧光素酶报告法蛋白免疫印迹实验测定miR-200C-3p与E盒结合锌指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2)的潜在关系。结果 qRT-PCR结果显示RWPE-1中miR-200C-3p表达量是DU145的2.5倍左右。DU145转染miR-200C-3p mimics后CCK-8实验组的增殖能力明显弱于对照组,划痕修复实验实验组[(20.33±1.45)%]与对照组[(46.67±2.40)%]相比愈合能力明显减弱(P<0.001),Transwell实验结果表明实验组(114.30±5.21)与对照组(212.00±6.49)相比迁移能力显著下降(P<0.001)。沉默ZEB2可抑制DU145细胞的增殖和迁移能力(P<0.05),双荧光素酶报告和蛋白免疫印迹实验证实miR-200C-3p在DU145中过表达降低了ZEB2的蛋白表达(P<0.05)。结论 miR-200C-3p通过介导ZEB2抑制DU145的增殖和迁移。