中药单体川楝素介导hsa-circ-0025583/hsa-miR-671-5p/SYNGR2轴调控乳腺癌生长的分子机制研究

目的 探究中药单体川楝素介导的hsa-circ-0025583/hsa-miR-671-5p/SYNGR2轴调控乳腺癌生长的分子机制。方法 选取南通第三人民医院乳腺外科于2020年4月—2022年4月收治的乳腺癌患者40例为研究对象,患者均在医院进行手术,取患者乳腺癌及癌旁组织作为实验材料,采用定量荧光聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)对其hsa-circ-0025583及SYNGR2的表达水平进行测定;取乳腺癌细胞株T47D细胞,加入不同浓度的川楝素,比较不同浓度川楝素对细胞增殖的抑制率;对所选乳腺癌细胞株系进行预处理,A组不进行特殊处理,B组中加入0.5μmol/L的川楝素,C组对乳腺癌细胞进行转染,敲除hsa-miR-671-5p,并向其中加入0.5μmol/L的川楝素,比较其hsa-circ-0025583及SYNGR2的表达水平,上述实验重复3次。结果 与正常癌旁组织相比较,乳腺癌组织中提取的hsa-circ-0025583及SYNGR2 mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。hsa-circ-0025583及SYNGR2 mRNA在乳腺癌组织中均低表达,具有正相关性(r=0.965,P<0.05)。随着川楝素浓度的升高,乳腺癌细胞增殖的抑制率逐渐升高,且与0μmol/L浓度组比较均具有统计学意义(P<0.05)。对数据进行处理,得出乳腺癌细胞在24 h及48 h的半数抑制浓度分别为0.78μmol/L、0.49μmol/L。与A、C组相比较,B组的hsa-circ-0025583及SYNGR2 mRNA的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);但A、C组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与A、C组相比较,B组24 h及48 h侵袭细胞数量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);但A、C组间侵袭细胞数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 川楝素通过介导hsa-circ-0025583/hsa-miR-671-5p/SYNGR2轴调控hsa-circ-0025583及SYNGR2水平,进而影响乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力,抑制乳腺癌细胞的生长。

NKX2-1-AS1介导miR-96-5p/PRDM16轴对未分化甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)NK2同源异形盒1-反义RNA 1(NKX2-1-AS1)介导微RNA(miR)-96-5p/含有PR结构域的蛋白16(PRDM16)轴对未分化甲状腺癌(ATC)细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长的影响。方法基于生物信息学筛选ATC组织及细胞中差异表达的lncRNA NKX2-1-AS1,并进一步筛选其靶基因miR-96-5p和下游靶基因PRDM16。双荧光素酶报告基因实验验证NKX2-1-AS1与miR-96-5p以及miR-96-5p与PRDM16之间的关系。Western blotting检测过表达miR-96-5p对NKX2-1-AS1过表达的CAL-62细胞PRDM16表达的影响。平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验分别检测敲减PRDM16对过表达NKX2-1-AS1的CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭的影响。裸鼠皮下注射CAL-62细胞,观察敲减PRDM16对NKX2-1-AS1过表达的CAL-62细胞移植瘤生长的影响。结果基于生物信息学筛选出参与调节ATC发展的NKX2-1-AS1/miR-96-5p/PRDM16轴。双荧光素酶报告基因实验验证结果显示NKX2-1-AS1与miR-96-5p、miR-96-5p与PRDM16结合。过表达NKX2-1-AS1上调CAL-62细胞中PRDM16蛋白表达;而过表达miR-96-5p可逆转此上调作用。过表达NKX2-1-AS1抑制CAL-62细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长;而敲减PRDM16可逆转此抑制作用。结论NKX2-1-AS1可能作为竞争性内源性RNA与miR-96-5p竞争结合下游靶基因PRDM16,上调PRDM16表达,从而抑制ATC细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长。

hsa-miR-204-5p对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响

目的:探究hsa-miR-204-5p对人血管内皮细胞活力、迁移、周期及凋亡等生物学行为的影响。方法:使用人脐静脉内皮细胞株EA.hy926构建过表达hsa-miR-204-5p(hsa-miR-204-5p mimics)模型。通过细胞划痕、Transwell、CCK-8、细胞周期和凋亡率等指标评估hsa-miR-204-5p对内皮细胞功能状态的影响。接着,使用RNA测序和RT-qPCR寻找并验证hsa-miR-204-5p的下游靶基因,将RNA测序中log2FC≤−0.5、P<0.05的基因和miRWalk数据库预测的hsa-miR-204-5p的下游靶基因取交集,并进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果:过表达hsa-miR-204-5p可以抑制EA.hy926细胞的活力和迁移能力,降低EA.hy926细胞的凋亡率,并使聚集在S期的细胞减少。富集分析结果发现hsa-miR-204-5p下游靶基因富集在MAPK信号通路,富集在此通路的基因为MAPT、PPP3R1、PRKACB、PTPRR、MAP2K4、CACNA2D2和RPS6KA6。RT-qPCR结果显示,过表达hsa-miR-204-5p后,MAPT和MAP2K4扩增结果较好且表达为下调。其中,MAPT下降趋势最明显。结论:hsamiR-204-5p可能通过抑制MAPT/MAPK信号通路而影响内皮细胞的活力、迁移和凋亡等生物学行为。

miR-2467、miR-96-5p在妊娠期糖尿病中的临床意义

目的:探讨微小核糖核酸-2467(miR-2467)、miR-96-5p在妊娠期糖尿病(GDM)中的临床意义。方法:纳入108例GDM住院患者作为GDM组,另选取同期产检的糖耐量正常孕妇82例为对照组。比较2组血清miR-2467、miR-96-5p相对表达量以及空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2hFBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),分析miR-2467、miR-96-5p与上述血糖指标的相关性。采用Logistic多元回归模型分析GDM发生的危险因素,绘制受试者工作特征曲线,分析miR-2467、miR-96-5p评估GDM的曲线下面积(AUC)。结果:GDM组血清miR-2467表达、FBG、2hPG、HbA1c水平及HOMA-IR高于对照组,miR-96-5p表达低于对照组(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示血清miR-2467表达与FBG、2hPG、HbA1c、HOMA-IR呈正相关,血清miR-96-5p表达与上述4项指标呈负相关(P均<0.05)。Logistic多元回归分析示孕早期BMI增长≥1.73kg/m^(2)、孕中期BMI增长≥4.88kg/m^(2)、糖尿病家族史、miR-2467≥3.44是GDM发生的危险因素,miR-96-5p≥1.95是GDM发生的保护因素(P<0.05)。血清miR-2467联合miR-96-5p评估GDM的AUC为0.865,敏感度、特异度分别为91.50%、81.50%。结论:miR-2467、miR-96-5p与GDM患者血糖指标及HOMA-IR存在相关性,对评估GDM具有一定意义。

七氟烷调控miR-96-5p/SIK1轴对胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨七氟烷调控微小RNA(miR)-96-5p/盐诱导激酶1(SIK1)轴表达对胃癌(GC)细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 以0、1%、2%、3%、4%、5%v/v浓度的七氟烷处理GC细胞SGC7901细胞,CCK-8法检测SGC7901细胞增殖情况;将SGC7901细胞随机分为对照组(正常培养)、七氟烷组(3%v/v七氟烷干预)、七氟烷+miR-NC组(转染miR-NC后再以3%v/v浓度的七氟烷干预48小时)、七氟烷+miR-96-5p mimics组(转染miR-96-5p mimics后,以3%v/v浓度的七氟烷干预48小时),RT-qPCR检测各组细胞中miR-96-5p表达;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室实验检测细胞侵袭;Western blot检测细胞磷酸化盐诱导激酶1(SIK1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-96-5p和SIK1的靶向关系。结果 与0浓度组相比,SGC7901细胞增殖抑制率在1%、2%、3%、4%、5%v/v浓度七氟烷处理下以剂量依赖性的方式显著增加(P<0.05),选取3%v/v浓度七氟烷进行后续实验;与对照组比较,七氟烷组细胞miR-96-5p表达水平、迁移、侵袭以及MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低,凋亡率和SIK1蛋白表达水平显著增加(P<0.05);激活miR-96-5p表达减弱了七氟烷对SGC7901细胞迁移和侵袭的抑制能力,降低细胞凋亡率(P<0.05);双荧光素酶报告基因结果表明miR-96-5p可靶向调节SIK1表达。结论 七氟烷可能通过下调miR-96-5p、上调SIK1抑制GC SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。

hsa-miR-340-5p靶基因预测及生物信息学分析

目的 通过对hsa-miR-340-5p的靶基因进行预测和生物信息学分析,探讨其靶基因所发挥的生物学功能及参与的信号传导通路。方法 应用RNAcentral和miRBase数据库在线对比分析miR-340-5p序列在不同物种之间的保守性。运用在线数据库DIANA-microT、Target Scan、miRWalk和miRDB分别预测hsa-miR-340-5p的靶基因,随后使用Venny2.1绘制韦恩图得到交集靶基因的集合,并对其交集靶基因的集合进行基因本体论(GO)功能注释分析、京都基因与基因组百科全书信号通路(KEGG Pathway)富集分析、蛋白互作(PPI)网络构建及关键(hub)基因筛选。结果 通过对比序列分析发现,miR-340-5p的成熟碱基序列在8个不同的物种中高度保守。采用4个miRNA靶基因在线数据库预测后,发现与hsa-miR-340-5p存在结合位点的交集靶基因集合共有92个,占其预测靶基因总和的1.9%。GO功能注释分析发现,hsa-miR-340-5p交集靶基因集合主要富集在核质、黏着斑、细胞间连接等细胞组分,同时,还参与了RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录和蛋白质结合等多种生物学过程和分子功能。KEGG Pathway富集分析发现,hsa-miR-340-5p所结合的交集靶基因集合主要富集在癌症中的蛋白多糖、癌症通路、人类嗜T细胞病毒Ⅰ型(HTLV-I)感染等7个信号通路中。基于hsa-miR-340-5p交集靶基因集合的PPI网络构建,筛选出了度(degree)值前10位的hub基因,分别是:母体抗生物皮肤生长因子同源物(SMAD)2、无翅型MMTV整合位点家族成员(WNT)3、激活素A的1C型受体(ACVR1C)、F-框蛋白(FBXO)30、重组人缺陷于清选蛋白neddylation蛋白1域含1(DCUN1D1)、PH结构域相互作用蛋白(PHIP)、CUB和Sushi多结构域(CSMD)3、分拣连接蛋白(SNX)9、人免疫缺陷病毒Ⅰ增强子结合蛋白(HIVEP)2、RWD结构域蛋白(RWDD)2A。结论 hsa-miR-340-5p调控的靶基因参与了癌症、炎症等疾病的多种生物学过程。

非酒精性脂肪性肝病患者血清miR-183-5p和miR-96-5p水平变化及其临床意义探讨

目的 探讨非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者血清miR-183-5p和miR-96-5p水平变化及其临床意义。方法 2019年11月~2022年1月我院诊治的NAFLD患者62例和同期性别和年龄相匹配且无过量饮酒史的健康体检者80例,采用实时荧光定量RT-PCR法检测血清miR-183-5p和miR-96-5p水平,应用多因素Logistic回归分析NAFLD发生的危险因素,应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)评估指标诊断严重脂肪性肝病的效能。结果 NAFLD患者BMI、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、空腹血糖(FPG)和血脂水平显著高于健康人(P<0.05),血清miR-183-5p和miR-96-5p水平分别为(0.8±0.2)和(1.2±0.3),显著低于健康人【分别为(1.4±0.4)和(2.3±0.6),P<0.05】;17例重度NAFLD患者血清miR-183-5p和miR-96-5p水平分别为(0.4±0.1)和(0.8±0.2),显著低于21例中度患者【分别为(0.8±0.2)和(1.2±0.3),P<0.05】或24例轻度患者【分别为(1.1±0.3)和(1.5±0.4),P<0.05】;经Logistic回归分析结果显示,BMI、HOMA-IR、FPG、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及血清miR-183-5p和miR-96-5p低水平是NAFLD发生的独立危险因素(P<0.05);应用血清miR-183-5p和miR-96-5p联合检测评估重度NAFLD发生的AUC为0.821,显著高于两项指标单独评估的0.713或0.718(P<0.05),其准确度、灵敏度和特异度分别达到77.4%、76.5%和77.8%。结论NAFLD患者血清miR-183-5p和miR-96-5p呈低水平,其水平越低,可能预示着肝内脂肪变程度越重,即它们的血清水平可在一定程度上反映疾病的严重程度,可作为诊断和评估病情的分子标志物,值得进一步研究。

新生儿脓毒血症血清miR-16-5p、miR-96-5p水平与疾病严重程度和机体炎性反应的相关性研究

目的探讨血清微小RNA-16-5p(miR-16-5p)和微小RNA-96-5p(miR-96-5p)水平与新生儿脓毒血症(NS)疾病严重程度和机体炎性反应的相关性。方法选择2020年3月—2022年3月海南现代妇女儿童医院收治的52例NS患儿作为脓毒血症组,同时选择同期住院的52例非脓毒血症患儿作为对照组。定量检测两组血清miR-16-5p、miR-96-5p、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)和白介素6(IL-6)含量,收集两组基线资料与入院24 h内临床检查结果。采用双变量Pearson相关性检验分析血清miR-16-5p、miR-96-5p水平与疾病严重程度和炎性反应指标的相关性。结果脓毒血症组格拉斯哥昏迷评分(GCS)、急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)、序贯器官衰竭估计评分(SOFA)、白细胞计数(WBC)、血肌酐、PCT、CRP和IL-6水平显著高于对照组,而血清白蛋白水平显著低于对照组(均P<0.05)。脓毒血症组血清miR-16-5p表达水平显著高于对照组,而miR-96-5p表达水平显著低于对照组(均P<0.05)。miR-16-5p高表达者的GCS评分、APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平均显著高于miR-16-5p低表达者(均P<0.05)。miR-96-5p高表达者的APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平均显著低于miR-96-5p低表达者(均P<0.05)。脓毒血症组血清miR-16-5p水平与GCS评分、APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平呈正相关(均P<0.05),而血清miR-96-5p水平与APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平呈负相关(均P<0.05)。结论NS患儿血清miR-16-5p水平升高,miR-96-5p水平降低,与疾病严重程度和机体炎性反应相关,提示miR-16-5p和miR-96-5p可作为NS早期诊断和病情评估的标志物。

高糖环境下miR-96-5p对人角质形成细胞的影响及相关机制研究

目的探讨高糖环境下miR-96-5p对人角质形成细胞的影响及相关机制。方法分离人角质形成细胞以50 mmol/L葡萄糖终浓度模拟高糖环境。通过转染miR-96-5p模拟物和抑制剂构建miR-96-5p过表达和抑制组,分为空白组、正常培养组、高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组、高糖培养+miR-96-5p inhibitor组。采用划痕实验观察细胞迁移水平,采用CCK-8实验观察细胞增殖水平,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。采用Western blot检测BNIP3、FAK、FAK磷酸化蛋白(p-F AK)蛋白的表达水平。结果50 mmol/L高糖处理后角质细胞折光性降低,同时细胞中出现空洞。与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点细胞迁移量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组细胞迁移量明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05);与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点细胞增殖量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组细胞增殖明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05);与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点细胞侵袭量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组细胞侵袭明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05);与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表达量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表达量明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05)。结论miR-96-5p可通过靶向调控BNIP3/FAK信号通路的表达从而影响角质细胞的增殖、侵袭和迁移能力,进而发挥影响糖尿病足创面愈合的作用。

hsa-miR-423-5p激活IL1R1基因在冠心病中的作用机制

目的:通过人群表达水平及转录组测序分析hsa-miR-423-5p靶向目标基因在冠心病(CHD)中的作用机制。方法:选取广西医科大学第一附属医院收治的151例CHD患者(CHD组),同期选择健康体检者作为健康对照组。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测外周血白细胞中hsa-miR-423-5p表达水平,通过Spearman相关分析对hsa-miR-423-5p与各临床指标的相关关系进行分析。在EA.hy 926细胞中过表达hsa-miR-423-5p后进行hsa-miR-423-5p的亚细胞定位实验及转录组测序。针对测序结果预测hsa-miR-423-5p的潜在靶基因,对其进行RT-qPCR实验验证并分析目标基因与hsa-miR-423-5p表达水平及各临床指标之间的相关关系。结果:CHD组外周血白细胞中hsa-miR-423-5p的表达水平显著低于健康对照组(P<0.05)。hsamiR-423-5p的表达量与总胆固醇(TC)呈负相关关系,与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)呈正相关关系(P<0.05)。在EA.hy926细胞中过表达hsa-miR-423-5p,亚细胞定位实验显示hsa-miR-423-5p主要存在于细胞核内。转录组测序结果经过分析验证后,发现过表达hsa-miR-423-5p后可上调IL1R1表达。CHD组中IL1R1的表达水平低于健康对照组(P<0.01),IL1R1表达水平与hsa-miR-423-5p表达水平、HDL-C均呈正相关关系(P<0.01)。结论:hsa-miR-423-5p及IL1R1在CHD患者中呈低表达且与TC和HDL-C相关;hsa-miR-423-5p在内皮细胞上调IL1R1的表达进而影响血脂水平,提示hsa-miR-423-5p可能通过调控IL1R1基因影响脂质代谢及内皮细胞功能从而参与CHD的进展。

miR-96-5p靶向PTEN激活PI3K-Akt信号通路抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭实验研究

目的:探讨miR-96-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、侵袭和增殖的作用及分子机制。方法:在人NSCLC细胞系A549中转染miR-96-5p类似物(miR-96-5p mimics)、阴性对照(NC mimics)或miR-96-5p抑制剂(miR-96-5p inhibitor)、阴性对照(NC inhibitor),通过CCK-8法检测细胞的增殖能力,通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移侵袭能力;采用荧光素酶报告基因实验检测miR-96-5p与磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)启动子区DNA的结合;采用蛋白质免疫印迹实验检测miR-96-5p对PTEN/PI3K/Akt信号通路的调控作用。结果:抑制miR-96-5p, NSCLC细胞的迁移、侵袭和增殖能力降低,过表达miR-96-5p促进NSCLC细胞的迁移、侵袭和增殖(均P<0.05)。荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-96-5p能与PTEN启动子区DNA结合;蛋白质免疫印迹实验结果表明,抑制miR-96-5p, PTEN表达升高、p-Akt的表达降低,过表达miR-96-5p后,PTEN表达降低、p-Akt的表达升高(均P<0.05),且沉默PTEN的表达后,逆转了敲低miR-96-5p对p-Akt的抑制作用(均P<0.05)。结论:miR-96-5p通过抑制PTEN,激活PI3K-Akt信号通路,促进NSCLC细胞的迁移、侵袭和增殖。

大黄素通过miR-96-5p靶向叉头蛋白K2减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞的损伤

目的:探讨大黄素通过miR-96-5p靶向叉头蛋白K2(FOXK2)减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞(MCs)损伤。方法:检测MRL/faslpr小鼠(狼疮性肾炎肾组)和MRL/MPJ小鼠(对照组)24 h尿蛋白以及血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)含量。MCs分离纯化后分为:MCs组(未做任何处理的MCs);L-EMO组(10μmol/L大黄素处理MCs)、M-EMO组(25μmol/L大黄素处理MCs)、H-EMO组(50μmol/L大黄素处理MCs)、H-EMO+miR-96-5p-NC组(50μmol/L大黄素处理MCs后转染miR-96-5p-NC)、HEMO+miR-96-5p-minic组(50μmol/L大黄素处理MCs后转染miR-96-5p-minic)。双荧光素酶报告基因实验验证miR-96-5p和FOXK2的靶向关系;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-96-5p表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测FOXK2以及凋亡相关蛋白表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测MCs炎性因子水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定MCs活力;Annexin-V FITC/PI双染法检测MCs凋亡情况。结果:与对照组相比,狼疮性肾炎组24 h尿蛋白含量、血清BUN和Scr水平显著升高(P<0.05);与MCs组相比,L-EMO组、MEMO组、H-EMO组miR-96-5p的表达量、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、A450值、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白水平依次显著下降(P<0.05),FOXK2水平、细胞凋亡率、Bcl-2相关的X基因(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3)蛋白水平依次显著升高(P<0.05),大黄素作用效果呈现剂量依赖性;与H-EMO组、H-EMO+miR-96-5p-NC组相比,H-EMO+miR-96-5p-minic组显著升高miR-96-5p的表达量、炎性因子水平、A450值以及Bcl-2蛋白水平(P<0.05),显著降低FOXK2水平以及细胞凋亡率(P<0.05)。结论:大黄素通过下调miR-96-5p进而上调FOXK2,从而减轻狼疮性肾炎MCs损伤。

MS相关的hsa-miR-17-5p靶基因预测和关键基因筛选

目的对人类miR-17-5p(hsa-miR-17-5p)靶基因预测和富集分析,并结合基因的差异表达寻找多发性硬化症的生物学标志物。方法利用生物信息学方法,预测hsa-miR-17-5p靶基因,对预测结果进行基因本体数据库(Gene Ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)富集分析,并构建蛋白质互作网络图(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)。再结合多发性硬化症患者和健康对照组的差异表达基因,进一步筛选出hsa-miR-17-5p对多发性硬化症影响的关键基因。最后,利用RNA22 v2验证关键基因是否存在结合位点。结果不同网站预测后,取交集获取376个公共靶基因,这些靶基因有复杂的相互作用,主要存在于胞浆与核质,参与多种转录调控和蛋白质磷酸化等生物学过程,同时也与癌症、病毒感染和免疫系统等信号通路相关;靶基因和多发性硬化症患者的相对下调基因有三个共同基因PDLIM5、KCNB1、BTBD7。进一步验证上述关键基因结合位点,发现仅有PDLIM5存在P值小于0.05的结合位点。结论hsa-miR-17-5p靶基因参与多种生物学过程,而且PDLIM5、KCNB1、BTBD7基因很可能是hsa-miR-17-5p对多发性硬化症产生影响的重要桥梁,其中PDLIM5尤为重要。

胃癌耐药相关hsa-miR-194-5p的靶基因预测及生物信息学分析

目的:研究胃癌耐药相关hsa-miR-194-5p的靶基因,并分析其参与的生物学过程和信号转导通路,为胃癌耐药机制的表观遗传学研究提供前期基础.方法:通过NCBI数据库检索hsa-miR-194-5p的基本信息;使用预测数据库预测hsa-miR-194-5p的靶基因;使用DAVID数据库对靶基因集合进行功能富集分析(GO)和信号转导通路富集分析(KEGG).结果:成熟的miR-194-5p序列多个物种之间具有高度保守性.预测靶基因共325个,参与的生物学过程主要有Golgi组织和细胞对DNA损伤刺激的反应(P<0.01),分子功能包括泛素蛋白连接酶结合和泛素介导的蛋白水解(P<0.01),细胞组分富集在细胞核和细胞表面,调控包括TGF-β和WNT等多条信号转导通路(P<0.01).结论:miR-194-5p的靶基因SMURF1、RAC1、MAPK1与胃癌细胞的增殖密切相关.

miR-96-5p通过下调肌动蛋白结合蛋白1促进卵巢癌干细胞顺铂耐药性

目的 探索微小核糖核酸(miRNA)miR-96-5p通过调控肌动蛋白结合蛋白1(profilin 1,PFN1)对卵巢癌干细胞(SiHa细胞)顺铂耐药的分子机制。方法 采用RT-qPCR检测miR-96-5p表达水平;将SiHa细胞置于不同浓度顺铂的培养基中,构建顺铂耐药细胞SiHa/DDP;采用Western blot检测蛋白的表达水平;双荧光素酶报告实验验证miR-96-5p与PFN1的靶向关系;MTT、Transwell和流式细胞术检测细胞增殖、侵袭和凋亡;成球实验检测细胞的成球能力。结果 miR-96-5p在SiHa细胞中高表达,且在SiHa/DDP细胞中的表达最高;敲降miR-96-5p可抑制SiHa/DDP细胞增殖、侵袭和干细胞成球能力并促进细胞凋亡;PFN1是miR-96-5p的潜在靶基因,过表达miR-96-5p通过下调PFN1促进SiHa/DDP细胞增殖、侵袭和干细胞成球,抑制细胞凋亡。结论 miR-96-5p通过靶向调控PFN1,促进SiHa/DDP细胞增殖、侵袭及其干细胞成球并抑制凋亡,从而增强SiHa/DDP细胞对顺铂的耐药性。

hsa-microRNA-96-5p down慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建hsa-microRNA-96-5p down慢病毒表达载体并对其进行鉴定.方法 根据hsa-miR-9-5p基因序列设计合成hsa-miR-96-5p-inhibition-a和hsa-miR-96-5p-inhibition-b,将合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中引物退火.将慢病毒GV280载体酶切产物通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接.经菌落筛选,菌落PCR及测序鉴定,荧光法及药筛法测定病毒效价.结果 菌落PCR和测序验证成功构建了hsa-miR-96-5p down慢病毒载体,经荧光法及药筛法测定病毒效价为3×108TU/ml.结论 成功构建了hsa-miR-96-5p down慢病毒表达载体,为后续深入研究miR-9-5p在肺癌细胞中的生物学行为及机制提供了前期实验基础.

microRNA-96-5p靶向调控羊驼黑色素细胞中MITF基因的表达

旨在预测并验证调控小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)基因表达的关键miRNA。使用在线软件对与MITF具有靶向关系的miRNAs进行预测。在羊驼黑色素细胞中,利用荧光定量PCR检测过表达和抑制表达miR-96-5p后MITF基因的表达量;通过免疫细胞化学技术对过表达和抑制表达miR-96-5p的细胞进行MITF特异抗体的染色。结果表明,miR-96-5p是调控MITF表达的一个关键miRNA,经荧光定量PCR、免疫细胞化学技术检测,当过表达miR-96-5p后,MITF mRNA水平不变,但其下游基因表达量极显著降低(P<0.01),MITF蛋白水平表达量与其下游基因的蛋白水平表达量全部极显著低于空白组(P<0.01),当抑制表达miRNA-96-5p后,MITF mRNA水平不变,但其下游基因表达量显著升高(P<0.01),MITF蛋白水平表达量与其下游基因的蛋白水平表达量全部极显著高于空白组(P<0.01)。miR-96-5p可以靶向结合MITF基因,在MITF转录后水平发挥调控作用,抑制MITF的转录,抑制MITF及其下游基因TYR、TYRP1、TYRP2的表达。

Hsa-miR-98-5p/DKK3信号轴对乳腺癌细胞生物学行为的影响

背景与目的:乳腺癌威胁着全世界女性的健康。虽然已发现大量微小RNA(microRNA,miRNA)在乳腺癌中异常表达,但仍需要构建一个完整的miRNA-信使RNA(messenger RNA,mRNA)网络。方法:利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载乳腺癌相关数据集,分析肿瘤组织与正常组织之间差异表达的miRNA。利用miRDB、miRTarBase和StarBase数据库分析差异miRNA靶向的基因。使用R语言中的ClusterProfiler包对靶基因进行富集分析。使用String数据库联合Cytoscape 3.6.2软件进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析及Hub基因的筛选;构建miRNA-Hub mRNA调控网络确定研究信号轴,然后通过细胞实验进行验证。结果:采用TCGA数据集识别出两个差异miRNAs。3个数据库取交集预测得到278个靶基因。共鉴定出10个Hub基因,从构建的miRNA-Hub基因网络图中发现,hsa-miR-98-5p/DKK3轴可能在乳腺癌的进展中起关键作用。细胞功能学实验证实hsa-miR-98-5p可抑制细胞凋亡,促进细胞的增殖、迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验进一步验证了hsa-miR-98-5p与DKK3的结合作用。结论:本研究首先通过生物信息学分析鉴定出一个与乳腺癌进展相关的hsa-miR-98-5p/DKK3轴,初步证实hsa-miR-98-5p可通过靶向DKK3抑制乳腺癌细胞凋亡,促进细胞的增殖、迁移和侵袭。

猪miR-96-5p组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期感染C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)攻毒组及对照组仔猪回肠组织高通量测序结果的基础上,为研究猪miR-96-5p在不同组织中的表达,分析其关键靶基因在仔猪感染C型产气荚膜梭菌导致腹泻过程中的调控作用.【方法】采用RT-qPCR方法检测miR-96-5p在仔猪各组织的表达量,构建组织表达谱,并检测对照组(IC)、易感组(IS)和耐受组(IR)回肠组织中miR-96-5p及其靶基因的表达量;利用生物信息学软件对miR-96-5p进行保守性分析、靶基因预测、GO功能和KEGG信号通路富集分析.【结果】miR-96-5p成熟体序列在不同物种间高度保守;预测到靶基因179个;预测获得与免疫炎症反应相关的信号通路有ErbB和MAPK;筛选到与仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染相关的靶基因有FOXO1、MAP2K1;RT-qPCR结果显示,miR-96-5p在回肠组织中高表达,且其在IC、IS、IR组回肠组织中的表达量与高通量测序结果趋势一致,其靶基因FOXO1、MAP2K1在IR和IS组的表达量均极显著低于IC组(P<0.01),IS组极显著低于IR组(P<0.01).【结论】miR-96-5p可能靶向调控FOXO1、MAP2K1参与仔猪感染C型产气荚膜梭菌性腹泻的过程.

MiR-96-5p靶向调控MTSS1表达对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨miR-96-5p对人结肠癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法应用miRNA转染技术,将miR-96-5p抑制物(miR-96-5p inhibitor)及microRNA无关序列(miR-NC)转染入结肠癌HCT116细胞中;采用免疫荧光及RT-PCR验证转染效率后,分别利用MTT、划痕实验、Transwell、凋亡实验检测miR-96-5p对结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡能力的影响;采用裸鼠皮下成瘤实验检测miR-96-5p对人结肠癌细胞成瘤能力的影响;miRNA靶基因预测软件分析miR-96-5p潜在靶目标并利用双荧光素酶报告基因和Western blot实验进行验证。结果免疫荧光及RT-PCR结果提示miR-96-5p inhibitor显著下调miR-96-5p在HCT116细胞中的表达。MTT、划痕实验、Transwell及凋亡实验结果提示下调miR-96-5p表达显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力并且促进细胞发生凋亡。裸鼠皮下成瘤实验提示过表达miR-96-5p能够促进结肠癌细胞成瘤能力,下调miR-96-5p的表达能够明显削弱其成瘤能力。miRNA靶基因预测软件分析提示MTSS1可能为miR-96-5p目标靶基因;双荧光素酶报告基因验证了miR-96-5p对MTSSI的靶向调控,且Western blot实验结果提示下调miR-96-5p可明显促进MTSS1蛋白在结肠癌细胞中的表达。结论下调miR-96-5p的表达可抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力并促进细胞发生凋亡,这种作用可能通过对MTSS1的靶向调控来实现。