嵌合DNA hsp70/CD80真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,并对其进行鉴定。方法 采用基因工程技术 ,分别以pBR32 2-hsp70和 pcDNA3-CD80质粒为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出hsp70 /CD80嵌合目的基因 ,然后与 pcDNA3载体进行连接重组 ,构建成hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定。结果 hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒经证实构建成功。 结论 hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒的成功构建 ,为进一步制备结核病hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗奠定了基础。

重组质粒pVAX1-Hsp70/CD80DNA疫苗体内外表达

目的构建p VAX1-Hsp70/CD80质粒,观察其在体内外的表达,初步评估其有效性和安全性。方法HindⅢ和XbaⅠ酶切质粒pc DNA3.1-Hsp70/CD80和载体p VAX1,将目的基因Hsp70/CD80定向连接入p VAX1中,鉴定构建的质粒p VAX1-Hsp70/CD8。将p VAX1-Hsp70/CD80质粒转染人胚肾293T细胞,Western blot法检测在转染细胞中Hsp70和CD80蛋白瞬时和稳定表达情况。用100μg p VAX1-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗免疫小鼠后,于第7天、15天、30天和180天用RT-PCR方法观察Hsp70和CD80在各组织中表达,Real time PCR检测IFN-γ和IL-4在脾脏中的表达。结果经酶切和测序鉴定,重组质粒构建成功。转染24、48和72 h后的细胞以及G418筛选的稳定表达细胞株均有Hsp70和CD80的表达。第7天和第15天肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾和胸腺组织均有Hsp70和CD80表达。第30天肌肉、肺和肝有Hsp70表达。第180天均未检测出Hsp70和CD80表达。第7天和第15天IFN-γ有较高水平表达。结论成功构建了p VAX1-Hsp70/CD80质粒,该重组质粒在一定时间内能高效表达Hsp70和CD80,并能诱导IFN-γ较高表达。

Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗对结核杆菌的治疗作用

目的 研究结核病Hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗结核杆菌感染小鼠的治疗作用。 方法用结核杆菌强毒株攻击小鼠后 ,接种Hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗 ,观察该疫苗对结核杆菌感染的治疗作用。结果 疫苗接种后 14d ,测得卡介苗组、注射 pcDNA3组、注射 pcDNA3 hsp70组及Hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗免疫小鼠的血清IFN γ分别为 (12 1.5 4 +5 6 .39) pg/ml、(192 .0 0 +6 4 .36 )pg/ml、(5 4 2 .33+99.77) pg/ml及 (1336 .98+12 9.6 4 ) pg/ml,嵌合DNA疫苗组与前三组比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。肝、脾组织涂片细菌计数及组织培育菌落记数 ,嵌合DNA疫苗组与其他组比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 Hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗与卡介苗及单一hsp70DNA疫苗相比 ,具有更好的免疫治疗效果。

CpG ODN联合HSP70/CD80DNA疫苗对哮喘小鼠血清IL-4、IL-13、IFN-γ及支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-25、IL-33的水平变化影响

目的研究非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)联合热休克蛋白70(HSP70)/CD80DNA疫苗对哮喘小鼠肺部炎症、血清IL-4、IL-13、IFN-γ及支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4、IL-25、IL-33水平变化的影响,为联合CpG ODN-HSP70/CD80 DNA疫苗治疗哮喘提供实验依据。方法 2019年6-9月选用6~8周龄BALB/c小鼠32只,卵清蛋白(OVA)加氢氧化铝[Al(OH)3]佐剂致敏的方法制备小鼠哮喘模型,随机分成4组,分别为对照组、哮喘组、HSP70/CD80DNA疫苗组及联合疫苗组(CpG ODN联合HSP70/CD80DNA疫苗组),HE染色观察肺组织病理形态学改变,ELISA法检测血清IL-4、IL-13、IFN-γ和BALF中IL-4、IL-25、IL-33水平变化。结果肺组织HE染色结果显示HSP70/CD80疫苗联合CpG ODN治疗组小鼠肺组织炎症反应较哮喘组明显减轻,气道周围炎症细胞浸润显著减少。ELISA结果显示与对照组比较,哮喘组血清IL-4及IL-13水平显著增高(P<0.05),血清IFN-γ水平明显下降(P<0.05);与哮喘组比较,HSP70/CD80DNA疫苗组和联合疫苗组血清IL-4及IL-13水平显著降低(P<0.05),血清IFN-γ水平明显升高(P<0.05);与HSP70/CD80DNA疫苗组比较,联合疫苗组血清IL-4及IL-13水平显著降低(P<0.05),血清IFN-γ水平明显升高(P<0.05);支气管肺泡灌洗液(BALF)结果显示与对照组比较,哮喘组BALF IL-4、IL-25、IL-33水平显著增高(P<0.05);与哮喘组比较,HSP70/CD80DNA疫苗组和联合疫苗组BALF IL-4、IL-25、IL-33水平显著下降(P<0.05);与HSP70/CD80DNA疫苗组比较,联合疫苗组BALF IL-4、IL-25、IL-33水平显著降低(P<0.05)。结论 CpG ODN联合HSP70/CD80DNA疫苗能抑制小鼠体内产生IL-4、IL-13、IL-25、IL-33,增强小鼠体内产生IFN-γ,减轻哮喘小鼠气道炎症。

血清HSP70、sCD74对慢性阻塞性肺疾病患者急性加重风险的预测效能

目的探讨血清热休克蛋白70(HSP70)、可溶性CD74(sCD74)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者急性加重风险的预测效能。方法选取2022年1—12月收治的COPD 103例为观察组,选取同期体检的健康者90例作为对照组。根据患者入院前1年内患者急性加重次数分为急性加重低风险组48例和急性加重高风险组55例。应用酶联免疫吸附试验检测血清热休克蛋白70(HSP70)、血清sCD74表达水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清HSP70、sCD74对COPD患者急性加重风险的预测价值;采用多因素Logistic回归分析COPD患者急性加重风险的影响因素。结果观察组血清HSP70水平低于对照组,血清sCD74水平高于对照组(P<0.01)。急性加重低风险组血清HSP70水平高于高风险组,血清sCD74水平低于高风险组(P<0.01)。血清HSP70、sCD74联合预测COPD患者急性加重风险的曲线下面积大于二者单独预测。HSP70<1.16μg/L,sCD74≥75.56 ng/mL是COPD患者急性加重高风险的危险因素(P<0.01)。结论低水平HSP70与高水平sCD74会增加COPD急性加重风险。HSP70、sCD74联合检测在COPD急性加重风险预测中具有较高效能。

Hsp70与肿瘤转移相关蛋白MMP-9,VEGF,E-cadherin和CD44v6对非小细胞肺癌转移的诊断价值分析

目的检测Hsp70与肿瘤转移相关蛋白MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6在非小细胞肺癌组织中的表达,探讨其表达与肺癌生物学行为的关系,以研究这些蛋白对非小细胞肺癌转移的作用,进而探讨其诊断价值。方法应用免疫组化方法检测60例肺癌组织标本以及9例癌旁正常组织中Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6的表达,采用统计学方法分析Hsp70与肿瘤相关转移蛋白的表达与患者的临床病理特征的关系。结果 Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6在肺癌组织中的阳性表达水平均明显高于在癌旁组织的表达,并且Hsp70、MMP-9及E-cadherin与肿瘤组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05),与肿瘤的分型无关(P>0.05);CD44v6与肿瘤组织学分级、分型、TNM分期均无关(P>0.05),与肿瘤的淋巴结转移有关(P<0.05);VEGF与肿瘤的分型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期均无关(P>0.05)。结论 Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6阳性表达预示非小细胞肺癌具有较强的侵袭和转移能力,可作为预测非小细胞肺癌转移潜能生物学指标。

吐温80合并温热诱导BGC-823胃癌细胞凋亡及对Hsp70,Bcl-2和Bax表达的影响

目的 观察膜活化剂吐温 80合并温热作用对BGC 82 3人胃癌细胞生长、凋亡及对Hsp70、Bcl 2、Bax表达的影响。方法 应用MTT法、荧光染色及DNA琼脂糖凝胶电泳 ,测定 0 1%吐温 80与 4 2℃ 10 0min合并作用对BGC 82 3细胞的抑制效应和诱导细胞凋亡的影响 ;应用免疫细胞化学染色 ,观察合并作用后不同时间 (0h、 8h、 16h、 2 4h)BGC 82 3细胞Hsp70、Bcl 2、Bax的表达改变。结果 ①吐温 80合并 4 2℃温热作用对细胞具有明显的抑制效应 (P <0 0 0 1)。②合并作用后 2 4h ,可见大量肿瘤细胞凋亡。③合并作用可明显抑制BGC 82 3细胞Hsp70的表达 ;Bcl 2、Bax的表达均增加 ,且Bax的表达强于Bcl 2 ,并全部分布在胞浆。结论 吐温 80合并 4 2℃温热可通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞生长 ,其对细胞Hsp70表达的抑制和对Bcl 2。

血瘀证患者血小板CD62p基因、白细胞HSP70基因的表达

目的从基因水平探讨血瘀证微观实质。方法以病证结合方式,严格按照诊断标准选取16 0例高血压病和2型糖尿病血瘀证(10 0例)和非血瘀证患者(6 0例) ,用血液生化指标和实验技术,进行血小板CD6 2 p基因、白细胞HSP70基因的表达的观察、对比、分析,并以健康人为对照。结果血瘀证患者存在CD6 2 p基因、HSP70基因的异常表达,两者表达水平较健康人显著升高(P <0. 0 1) ,且基因异常表达水平的高低与血瘀证各型之间存在密切关系。结论CD6 2p基因和HSP70基因为与血瘀证有密切相关的基因。

十二井穴流注放血干预急性脑缺血模型大鼠HSP70及CD31表达的研究

目的探究十二井穴流注放血对急性脑缺血(ACI)模型大鼠HSP70及CD31表达的作用。方法60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、普通放血组、流注放血1组、流注放血2组、西药组,每个组10只,局灶性凝结大脑中动脉法制备ACI模型后分组治疗。神经功能缺陷评分量表(m NSS)评价治疗前后各组大鼠神经功能,HE染色观察各组大鼠脑组织病理变化。免疫组织化学观察大鼠缺血区脑组织内HSP70及CD31蛋白表达变化。结果各组大鼠治疗后m NSS评分均较治疗前显著降低,西药组改善大鼠mNSS评分效果优于普通放血组和流注放血1组并与流注放血2组治疗效果无显著性差异。HE染色结果显示流注放血2组及西药组大鼠脑组织病理结构较模型组显著恢复,神经元形态完整。免疫组化结果显示,治疗后各组大鼠脑组织中HSP70及CD31蛋白表达均高于模型组(P<0.05),西药组HSP70及CD31含量显著高于普通放血组和流注放血1组(P<0.05),并与流注放血2组无明显差异(P>0.05)。结论十二井穴流注放血可能通过促进HSP70及CD31的表达发挥对ACI大鼠的保护作用。

CD105、P63、HSP70在尖锐湿疣中的表达

目的:评价CD105、P63、HSP70在尖锐湿疣(CA)中的表达及其在CA发病中的作用。方法:应用免疫组织化学S-P法检测50例CA患者的手术切除标本及10例正常包皮中CD105、P63、HSP70的表达。结果:(1)CD105在CA组织中表达于新生血管内皮细胞,几乎不表达于正常组织;(2)P63在CA组织中主要表达于基底层、棘层和颗粒层,正常组织中主要表达于基底层;(3)HSP70在CA组织中表达于胞浆和胞核;(4)CA组织中,CD105、P63、HSP70三者间无相关性(P>0.05)。结论:以CD105标记的MVD值及P63、HSP70在CA组织中均高表达,且三者无相关性,提示它们作为不同的中间介质可能在CA发病机制中发挥重要作用。

吐温80合并温热对B16黑色素瘤细胞hsp70、c-fos、Ubiquitin蛋白表达的影响

吐温８０合并温热对Ｂ１６黑色素瘤细胞ｈｓｐ７０、ｃ－ｆｏｓ、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ蛋白表达的影响杨耀琴杨虎川陶惠红朴文姬（上海铁道大学基础医学院组胚教研室）本研究通过免疫组织化学方法，观察吐温８０与温热合并作用后即时、４ｈ和３ｄ后，Ｂ１６肿瘤细胞热休克蛋...

CD62p和HSP_(70)基因在高血压病患者白细胞中的表达

目的 :从基因水平探索高血压病的微观机制。方法 :以病证结合方式及现代流式细胞技术 ,对高血压病患者进行 CD2 6p、HSP70 基因表达的观察、对比、分析 ,并以健康人为对照 ,从基因层次探索高血压病形成的微观机理和演变规律。结果 :高血压病患者白细胞CD62 p和 HSP70 基因表达水平显著高于正常对照组 ( P<0 .0 1 )。结论 :高血压病患者存在HSP70 基因表达的异常 。

河流型水牛热休克蛋白70(HSP70)基因CDS序列的多态性分析

为了研究河流型水牛HSP70基因CDS序列的多态性,试验首先从摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、槟榔江水牛、地中海水牛冷冻精液中抽提基因组DNA,以基因组DNA为模板扩增获得河流型水牛HSP70基因,对其进行基因克隆,测序,序列分析;其次对26头摩拉水牛、43头尼里/拉菲水牛HSP70基因CDS序列进行测序、高分辨率熔解曲线检测分析。结果显示:河流型水牛的HSP70基因CDS序列长度为1927bp,4个品种HSP70基因CDS序列相似度高达99%以上;摩拉、尼里/拉菲种公牛HSP70基因CDS序列存在相同的SNP位点,分别是C602T、A708T、A1284G,并产生不同的基因型。摩拉公牛HSP70基因CDs区602bp位点、尼里/拉菲602bp位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态。试验结果说明了HSP70基因在进化上具有高度保守性,但在同一群体中存在多态性。

HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究HSP70-TKD诱导的自然杀伤细胞(NK)对胰腺癌原位移植模型的体内抗肿瘤作用。方法:用干细胞培养基富集人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天时,加入2μg/ml TKD,4 d后用流式细胞仪检测诱导后NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达情况,MTT法测定诱导后NK细胞体外对细胞表面HSP70表达阳性的胰腺癌Colo357细胞的杀伤活性。在BALB/c裸鼠胰腺原位接种胰腺癌Colo357细胞至第15天时,尾静脉注射HSP70-TKD诱导的NK细胞,观察NK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。免疫组化染色检测NK细胞在胰腺癌组织的浸润情况。结果:NK细胞在干细胞培养基中可大量增殖,14 d时平均细胞纯度为(87.50±1.35)%。HSP70-TKD诱导的NK细胞其细胞表面CD94/NKG2C的表达明显增加,其平均荧光强度为(220.56±6.82),高于未诱导组的(68.72±1.85)。HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞Colo357有更强的杀伤活性,当效靶比为40∶1时杀伤率高达(68.72±2.55)%。体内实验表明,TKD诱导的NK细胞能显著抑制胰腺癌的生长,其抑瘤率可达(61.3±1.5)%,与对照组差异显著(P<0.01)。免疫组化染色表明IL-2和TKD同时诱导的NK细胞更易向胰腺癌组织浸润。结论:HSP70-TKD诱导的NK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞,具有较强的体外抗细胞表面HSP70表达阳性的胰腺癌细胞活性,具有明显的抑制胰腺肿瘤生长的作用。

热疗促进HSP70表达对免疫效应细胞杀伤肿瘤的影响

目的: 探讨热疗通过促进乳腺癌药物敏感细胞株与多药耐药细胞株表达热休克蛋白 (HSP)70,提高免疫效应细胞对靶细胞的杀伤活性。为开展基于热疗的细胞免疫治疗提供实验依据。方法: 采用IFNγ、CD3单抗、IL 1和IL 2等细胞因子诱导并扩增免疫效应细胞。分别给予乳腺癌药物敏感株MCF7和耐受株MCF7 /ADR非致死温度热冲击 42℃ 1h,继续培养 4h, 24h, 48h后收获细胞,用流式细胞术检测靶细胞上HSP70的表达。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定靶细胞增殖活性以及免疫效应细胞对靶细胞的杀伤活性。结果: HSP70在两种靶细胞上的表达有差异,加热前MCF7 /ADR细胞HSP70表达明显高于MCF7,加热后 4h,HSP70在MCF7 /ADR表达提高了 6倍,在MCF7表达提高了 22倍,超过了耐药株。药物敏感株MCF7增殖的热抑制率低于耐药株MCF7 /ADR。热冲击前免疫效应细胞对MCF7细胞的杀伤活性低于MCF7 /ADR细胞。热冲击后免疫效应细胞对MCF7的杀伤活性提高了 86. 23%,超过了对MCF7 /ADR的杀伤活性 (提高了 30. 32% )。结论: 热疗明显提高HSP70在乳腺癌药物敏感与耐受细胞系上的表达,增加了免疫效应细胞对这两种靶细胞的杀伤活性。HSP70在乳腺癌药物敏感与耐受细胞系上的差异性表达对免疫效应细胞的杀伤活性有影响。

慢性萎缩性胃炎脾胃湿热证与热休克蛋白60、70及CD44s、CD44v6的相关研究

为探讨慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)脾胃湿热证与热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白70(HSP70),细胞粘附分子标准型CD44蛋白(CD44s)及CD44的变异体(CD44v)之一CD44v6之间的关系,选择CAG患者71例进行胃镜检查,胃窦部活检标本行快速尿素酶试验及13C呼气试验,检测幽门螺旋杆菌(Hp),病理诊断和HSP60、HSP70、CD44s及CD44v6的免疫组织化学染色,分析比较它们的相关性。结果:①脾胃湿热组的萎缩和肠化程度高于脾虚组(P<0．05～0．01);②正常对照组胃粘膜内HSP60主要呈阴性或弱阳性表达,CAG脾胃湿热组及脾虚组患者胃粘膜内HSP60表达增强,且二者Hp的感染率均高于正常对照组(P<0．05～0．01),Hp的感染情况与HSP60的表达呈非常显著相关(P<0．01)。脾胃湿热组HSP60 表达与脾虚组相比无显著性差异,但脾胃湿热组HSP60表达有增强的趋势;③脾胃湿热组HSP70的表达与正常对照组、脾虚组相比无显著性差异(P>0．05),但脾胃湿热组强阳性表达率(71．0％)高于脾虚组(47．5％)(P <0．05);④脾胃湿热组CD44s和CD44v6的表达与正常对照组和脾虚组相比无显著性差异(P>0．05)。说明;①CAG脾胃湿热组胃粘膜的萎缩和肠化程度均重于脾虚组,可能是由于脾胃湿热证与炎症关系密切所致。②CAG脾胃湿热组及脾虚组HSP60的表达均较正常对照组增强,原因可能与Hp感染有关。③CAG脾胃湿热组HSP70的强阳性表达率强于脾虚组。④3组之间CD44s和CD44v6的表达无明显差异,说明CAG作为胃癌前疾病尚未出现CD44s和CD44v6的异常表达。

肺癌骨转移患者放疗前后HSP70水平和Treg比例变化及其与疗效的关系

目的观察肺癌骨转移患者放疗效果与生存期间关系,同时观察放疗前后患者CD3+CD8+T细胞比例、NK细胞比例、血清HSP70蛋白水平及Treg细胞比例的变化。方法观察30例肺癌骨转移患者,给予放射线治疗并观察其生存期。治疗前后取患者外周血标本检测患者外周血CD3+CD8+T细胞比例、NK细胞比例、HSP70蛋白及Treg细胞比例。结果放疗骨痛缓解组较未缓解组患者生存期明显延长,缓解组生存期为158.6±12.38天,未缓解组生存期为71.75±16.81天,统计学分析两组间研究对象生存时间存统计学差异,P=0.004。放疗骨痛缓解组血清HSP70蛋白水平由放疗前的4.52±1.83ng/ml降低至放疗后的2.87±0.92ng/ml,Treg细胞比例由放疗前的4.62±0.87降低至放疗后的2.68±0.65,差异有统计学意义,而未缓解组放疗前后无统计学差异。两组间CD3+CD8+T细胞比例、NK细胞比例在治疗前后均无明显变化。结论肺癌骨转移患者在接受放射治疗后联合免疫细胞治疗或能提高治疗效果。

吐温80合并温热诱导BGC-823细胞的抑制作用及对凋亡相关因子的影响

目的 观察膜活化剂吐温 80合并温热作用对人胃癌细胞BGC 82 3的抑制效应及其对Hsp70、bcl 2、bax表达的影响。方法 通过MTT法 ,测定 0 .1%及 0 .15 %吐温 80与 4 2℃温热合并作用对BGC 82 3细胞的抑制作用 ;运用免疫细胞化学染色 ,观察 0 .1%吐温 80与 4 2℃温热合并作用后 (0h、8h、16h、2 4h)BGC 82 3细胞Hsp70、bcl 2、bax表达的改变。结果 吐温 80合并 4 2℃10 0min温热作用对BGC 82 3细胞具有明显的抑制效应 ,温热后保留吐温 80继续作用将进一步增强抑制效应 ,合并抑制效应与吐温 80浓度相关 (P <0 .0 1)。合并作用能明显抑制BGC 82 3细胞热作用后的Hsp70表达 ,但bcl 2、bax的表达均增加 ,且bax的表达强于bcl 2 ,并全部分布于胞浆。结论 吐温 80与 4 2℃温热有明显协同抑制肿瘤细胞生长效应 ,对Hsp70和bcl 2、bax表达及分布的影响提示其抑制机理可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。