计算机辅助设计可溶性BLyS受体,eBCMA-Fc融合蛋白及其在大肠杆菌中的表达(英文)

B细胞成熟抗原(BCMA)是B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的受体之一.它的胞外区与人IgG1Fc的融合蛋白eBCMA-Fc,又称为诱饵受体,具有拮抗BLyS的活性.为了设计新的拮抗肽,基于BCMA和Fc的晶体结构,通过计算机图形学技术、分子模拟方法,建立了eBCMA-Fc融合蛋白的三维理论结构.利用均方根位移(root mean square distance,RMSD)对eBCMA-Fc融合蛋白与单体eBCMA、Fc构象差异进行分析.融合蛋白eBCMA-Fc中的eBCMA段与单体eBCMA的主链碳原子间RMSD值为0.036nm,Fc段与单体Fc的主链碳原子间RMSD值为0.064nm.结果表明,对比单体,融合蛋白eBCMA-Fc并未因eBCMA与Fc直接连接而发生构象的变化.分子对接方法显示,融合蛋白eBCMA-Fc中的BCMA与BLyS作用,而Fc扮演着稳定BCMA构象的支架作用.为进一步验证上述理论分析,构建eBCMA-Fc融合基因,并将载有eBCMA-Fc融合基因的原核表达质粒转化BL21(DE3)菌、在细菌中表达.目的蛋白经蛋白A亲和柱纯化大约为36kD,与理论预测值34kD相近.免疫印迹表明抗人IgG抗体能够识别eBCMA-Fc融合蛋白.ELISA证实,eBCMA-Fc融合蛋白能够结合BLyS.随着eBCMA-Fc融合蛋白增加,结合BLyS的融合蛋白也相应增加.而对照人IgG,即使在高浓度条件下,也不结合BLyS.此外,eBCMA-Fc融合蛋白能够抑制BLyS对B细胞肿瘤Daudi细胞的作用.这些研究为下一步设计和筛选BLyS拮抗肽提供了实验基础.

B淋巴细胞刺激因子(BLyS)研究进展

B淋巴细胞刺激因子 (BLyS)是 1999年新发现的一种重要的细胞因子 ,属于肿瘤坏死因子 (TNF)超家族成员 .在体液免疫调控中起重要作用 .它能强烈地刺激B淋巴细胞的增殖和分化并分泌大量免疫球蛋白 (主要为IgM) ;在体外其过量表达能促进多种B系肿瘤细胞的生长 .BLyS转基因小鼠出现严重的红斑狼疮样症状 .对BLyS的基因和蛋白质结构、免疫调控功能。

过敏性紫癜患者血清中TRANCE和BLys的检测

目的了解TRANCE和BLys在过敏性紫癜发病中的作用。方法通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测过敏性紫癜患者血清中TRANCE和BLys的表达水平。结果过敏性紫癜患者血清中TRANCE和BLys的表达水平(2.83±0.96,90.48±2.64)与正常对照组(0.85±0.35,82.02±4.04)相比均升高(P<0.01),伴有肾脏损害患者血清中TRANCE,BLys的表达水平(4.09±0.45,93.92±2.07)与单纯型患者(2.44±0.70,89.42±1.75)相比显著增高(P<0.01)。患者血清中TRANCE与BLys的表达水平呈显著正相关(r=0.515,P<0.01)。结论过敏性紫癜患者血清中TRANCE,BLys的表达异常增高,可能与其发病有关。

sBLyS突变体酵母表达载体的构建

目的构建人BLyS胞外区(soluble BLyS)突变体毕赤酵母分泌型表达载体,为深入探讨BLyS的功能和机制创造条件。方法以构建的人pUC19/sBLyS及其突变体重组质粒为模板,利用PCR扩增出6×his/sBLyS及其突变体的cDNA,克隆入酵母表达载体pPIC9K;行序列测定后电转化入毕赤酵母GS115,并进行表型筛选和G418抗性筛选;对高拷贝整合的重组酵母表达菌株进行PCR鉴定。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K/6×his/sBLyS及其突变体;经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母表达菌株。结论成功构建了人sBLyS及其突变体的真核表达载体,为获得人sBLyS及其突变体蛋白,进一步研究BLyS的生物学功能奠定了基础。

人BLyS基因克隆、表达和抗人BLyS单克隆抗体的制备

【目的】研制抗人BLyS单克隆抗体 ,以进一步探讨人BLyS与自身免疫性疾病的关系。【方法】将人BLyS基因克隆到融合蛋白原核表达载体 pGEX 4T 1中 ,构建重组质粒 pGEX 4T 1/hBLyS ,用此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,加IPTG诱导大肠杆菌表达GST hBLyS融合蛋白 ,用此融合蛋白免疫BALB/c鼠 ,取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合 ,用ELISA法筛选阳性克隆 ,用免疫印迹和流式细胞仪进一步鉴定抗体的特异性。【结果】重组质粒双酶切结果和DNA序列测定以及表达蛋白SDS PAGE电泳结果表明 ,pGEX 4T 1/hBLyS重组质粒可以正确表达GST hBLyS融合蛋白 ;ELISA、免疫印迹和流式细胞仪检测结果表明 ,1c6杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合人T淋巴细胞膜表面BLyS的膜外区 ,属于IgG2b亚类。【结论】所获得的单克隆抗体具有能够结合人T淋巴细胞上的BLyS特异性 。

重组人B淋巴细胞刺激因子纯化及其生物活性鉴定

目的 获得高纯度和高活性的B淋巴细胞刺激因子。方法 重组原核表达载体pQE 80L BLyS112 -2 85在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导表达rhBLyS112 -2 85,超声碎菌 ,提取包涵体 ,经Ni2 + NTA亲和层析和SepharcrylS 2 0 0凝胶过滤层析纯化后 ,选择不同氧化还原条件进行复性 ,进而检测其生物学活性。结果 得到了有较高纯度和较好生物学活性的rhBLyS112 -2 85蛋白。结论 优化了BLyS蛋白的纯化和复性的参数 。

抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库的构建

目的构建抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库。方法从B-淋巴细胞刺激因子免疫小鼠的脾细胞中抽提总RNA,经逆转录聚合酶反应合成cDNA,分别扩增小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因。通过重叠延伸拼接法将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成单链抗体基因,重组于载体pFUSE5,电转化E.coliXL 1-Blue。在辅助噬菌体援救下,构建成噬菌体单链抗体库。采用聚合酶链反应、核苷酸序列测定和酶联免疫分析鉴定单链抗体库的特征。结果本抗体库的噬菌体库容量约1×106,单链抗体基因插入效率为93%,存在序列差异性并含有抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体。结论成功地构建了抗人B-淋巴细胞刺激因子单链噬菌体抗体库,为筛选抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体药物奠定了良好的基础。

B淋巴细胞刺激因子的药学前景

B淋巴细胞刺激因子(BlyS)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一名新成员,它与某些免疫疾病的致病机制密切相关。从BlyS的生物学结构和功能入手,阐述与其相关的免疫缺陷病、自身免疫疾病和淋巴瘤等免疫疾病,以及BlyS治疗性蛋白、BlyS蛋白拮抗物、放射性BlyS蛋白的临床应用前景。

抗B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体对系统性红斑狼疮患者外周血表达的影响

目的利用体外细胞培养技术研究抗B淋巴细胞刺激因子(BlyS)单克隆抗体对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中相关因子的影响。方法抽取36例SLE患者外周血,每例外周血分成等份分别不加或加入抗BlyS单克隆抗体分组培养,检测比较培养后各组血浆中的免疫球蛋白、补体和多种狼疮相关细胞因子含量的差异。结果狼疮组加入抗BlyS单克隆抗体培养后,血浆中的IgG、IgM水平均比未加单抗组培养后的水平低,IgA水平仅有下降趋势;血浆补体C3、C4水平较未加单抗组高;且血浆中狼疮相关细胞因子BlyS、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6水平均较未加单抗组低。结论抗BlyS单克隆抗体在体外能够抑制狼疮患者外周血中的免疫球蛋白过度升高和补体的下降,以及狼疮相关损害因子偏高。

B淋巴细胞刺激因子与系统性红斑狼疮

B淋巴细胞刺激因子(Blys)是肿瘤坏死因子配体超家族成员,可刺激B淋巴细胞增殖、分化及分泌抗体,对机体的免疫应答、尤其是体液免疫应答起着关键性作用。Blys缺陷或过量表达均可引起机体免疫失衡,诱发多种自身免疫性疾病。Blys mRNA可能是SLE疾病活动性的一个有用的生物学标志,Blys拮抗剂为SLE的治疗带来新的研究方向。

多发性骨髓瘤中MAPK信号通路对BLyS表达的调控研究

目的 研究多发性骨髓瘤（MM）细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的表达及活化情况,探讨MAPK信号通路对MM细胞B淋巴细胞刺激因子（BLyS）表达变化的影响及对MM细胞增殖与存活的影响,并初步探讨MAPK信号通路在IFN-γ（MM重要的促生长因子）上调MM细胞BLyS表达过程中的作用.方法 应用Western blot方法检测MM细胞中蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38的表达情况；应用RT-PCR及Western blot检测MAPK信号通路对BLyS表达的影响；应用WST-1法检测靶向JNK的MAPK信号通路抑制剂SP600125对MM细胞增殖与存活的影响.结果 MM细胞株中,除了ERK、JNK及p38的表达外,还有活化蛋白p-JNK的表达；靶向JNK的MAPK信号通路抑制剂SP600125可下调MM细胞BLyS的表达,其激动剂茴香霉素（anisomycin）可上调BLyS的表达；IFN-γ可上调MM细胞BLyS的表达,SP600125可部分抵消IFN-γ对BLyS的上调作用；SP600125可抑制MM细胞的增殖与存活.结论 MM细胞中有JNK/SAPK信号通路的活化；JNK/SAPK信号通路的活化程度与BLyS的表达高低呈正相关；JNK/SAPK信号通路在IFN-γ上调MM细胞BLyS表达过程中发挥重要作用.

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。

B淋巴细胞刺激因子及其受体在多发性骨髓瘤中的表达及其意义

目的探讨B淋巴细胞刺激因子（BLyS）及其受体在多发性骨髓瘤（MM）中的表达及其意义。方法采用流式细胞术（FCM）分析人MM肿瘤细胞系KM3及CZ-1细胞表面BLyS及其受体的表达；RT—PCR及Western blot进一步验证BLyS及其受体的表达；采用荧光免疫细胞化学法和激光共聚焦技术鉴定KM3细胞中BEyS蛋白的表达与定位；WST细胞增殖实验检测BLyS对MM肿瘤细胞生长与存活的影响。ELISA及荧光定量-聚合酶链反应（RTQ-PcR）测定MM患者BLyS蛋白与mRNA的表达水平。同时分析乳酸脱氢酶（LDH）、β2微球蛋白浓度与BLys蛋白及mRNA表达水平的关系。结果①MM细胞能够表达BLyS及其受体；②BLyS定位表达于KM3细胞的浆膜上；③BLyS促进MM细胞的生长与存活；④MM患者BLys蛋白或mRNA表达水平显著高于正常对照组（P值均〈0．01）；⑤直线相关分析显示LDH、β2微球蛋白浓度与BLyS蛋白及mRNA表达水平呈显著相关性。结论BLyS及其受体对于MM发生、发展可能起着重要的作用。

注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白对大鼠生育力及早期胚胎发育的毒性作用

目的观察注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对大鼠生育力及早期胚胎发育的毒性作用。方法将SD大鼠随机分为4组,分别经皮下注射RCT-18 129、37、11 mg/(kg.d)和0.9%NaCl注射液,每2 d给药1次。雄鼠连续给药5周、雌鼠连续给药2周后,按雌雄1∶1的比例合笼交配,合笼期为2周,计算交配率。雄鼠继续给药至交配成功,雌鼠继续给药至妊娠第6天。实验过程中观察动物的一般反应、体重及摄食量变化。确定雌鼠受精后处死雄鼠,解剖检查睾丸和附睾等生殖器官。于妊娠第15天解剖孕鼠,综合评价妊娠及胚胎形成和早期发育等情况。结果 RCT-18高、中、低剂量组雌性和雄性大鼠均未出现明显的母体毒性反应。各组大鼠各脏器均未见肉眼可见的异常。各剂量RCT-18对大鼠的交配率、妊娠率、生殖系统脏器重量和系数以及早期胚胎发育均无明显影响。结论RCT-18对SD大鼠的生育力及早期胚胎发育无明显毒性作用。

重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白质控方法和质量标准的建立

目的建立重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(TACI-Fc)的质控方法和质量标准。方法采用以B淋巴细胞刺激因子作为配体的受体结合法测定TACI-Fc的生物学活性;反向液相色谱(RP-HPLC)法测定蛋白含量及纯度;ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A;胰蛋白酶酶切后分析肽图;其余检测项目均按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果用建立的方法对重组人TACI-Fc原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。

注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白对家兔胚胎及胎仔发育的毒性作用

目的观察注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对家兔胚胎及胎仔发育的毒性作用。方法将受精后的雌兔随机分为RCT-18高、中、低剂量组和阴性对照组,每组15只,于妊娠第6～18天分别经皮下注射RCT-18 51.3、14.7、4.4 mg/(kg.d)和0.9%NaCl注射液,每2 d注射1次,共7次。实验过程中每天观察动物的一般反应、体重及摄食量变化,于妊娠第28天解剖孕兔,对着床、吸收胎、死胎、活胎、黄体进行计数,对胎仔的体重、身长、尾长以及外观形态、内脏和骨骼发育等指标进行考察。结果各组孕兔、胚胎形成、胎仔生长发育、外观形态、内脏和骨骼发育等各项指标均无明显异常,与阴性对照组比较,多数指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RCT-18对妊娠家兔未见明显母体毒性和胚胎-胎仔发育毒性,无致畸作用。

重组人细胞白介素2治疗类风湿关节炎合并干燥综合征的临床效果及对血清B淋巴细胞刺激因子水平的影响

目的探讨重组人白介素2(recombinant human interleukin-2,rh IL-2)治疗类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)合并干燥综合征(sjogren syndrome,SS)的疗效,以及对血清B淋巴细胞刺激因 子(B lymphocyte stimulator,Blys)水平的影响。方法选取湖北民族学院附属民大医院2014年2月至 2017年6月RA合并SS患者60例,随机分为两组,治疗组(30例),给予rh IL-2每天5万IU皮下注射,连续治疗5 d,对照组(30例)给与常规抗免疫治疗。应用Schinner试验、唾液流率评价患者SS症状改善情况,应用类风湿关节炎疾病活动评分(28 joint disease activity Score,DAS28),关节肿胀的压痛指数评 价患者RA症状改善情况。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,EUSA)检测患者 血清Blys和免疫指标,并对比治疗前后的差异。结果治疗后左眼泪流量改善差值1.51 (95% CI:0. 938-2.082)mm/min、右眼泪流量改善差值1.67 (95% CI:1.095-2. 245) mm/min、唾液流率改善差值 0.21(95% CI:0.049<0.371)mL/min。治疗组患者治疗后Schirmer试验、唾液流率指标均优于对照组 (P<0.05)。治疗组关节肿胀的压痛指数(2.05±0.03)得分较治疗前明显降低(P <0.05)且低于对照 组(P<0.05)。治疗组RA缓解比例较治疗前增高40%(P<0.05)且显著高于对照组(P<0.05)。治 疗后红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation tale, ESR)、C 反应蛋白(C reaction protein,CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)显著下降(P<0.05)。两组治疗后 ESR 改善差值 3.72 ( 95% CI:1.03,5.06)mm/h,CRP 改善差值 1.95(95% C1:0.68,3.47)g/L,IgG 改善差值 2.01 (95% CI:0? 69,4.93)g/L,治疗组患者治疗后血清免疫指标均优于对照组(P<0. 05 )。治疗组患者血清Blys由治疗前(8. 34 ± 3_19)1>8/11^下降到(4.72±2.16)116/1^,差异明显(/><0.05),对照组血清8178治疗后与治疗前对比无 统计学差异(P>0.05)。结论AIL-2通过降低血清BlyS水平减轻自身免疫反应,改善RA合并SS临 床症状,对RA合并SS的治疗效果明显。

RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量

目的:建立测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(简称TACI-Fc)含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。色谱柱为VydacC18,流动相A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液,流动相B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,梯度洗脱,流速为1.3mL·min-1,检测波长为280nm。结果:TACI-Fc进样量在5.0～20.0μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.9997);方法平均回收率为99.71%,RSD=1.14%(n=9)。结论:本方法操作简便、重复性好、结果准确,适用于测定注射用TA-CI-Fc的含量。