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Directed Evolution of Human Cu,Zn-SOD Under Artificial Oxidant Pressures
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作者 GOU Xiao jun LI Chun lei +5 位作者 KONG Xiang duo ZHU Shi zhen ZHANG Hong ying WANG Xiao ping ZHANG Jin LIU Tian yun 《Chemical Research in Chinese Universities》 SCIE CAS CSCD 2002年第3期294-298,共5页
Cu,Zn SOD is a highly conserved enzyme and the controversy about its evolutionary possibility in the near future has been lively. In order to further our understanding of the future fate of human Cu,Zn SOD, we adopt... Cu,Zn SOD is a highly conserved enzyme and the controversy about its evolutionary possibility in the near future has been lively. In order to further our understanding of the future fate of human Cu,Zn SOD, we adopted a strategy relating to the directed evolution to study how the mutants of human Cu,Zn SOD respond to different oxidative stress. After five rounds of screening, we found a mutant that can survive under harsh pressures and DNA sequencing proves that it shows a mutation responsible for the phenomenon. However, under natural pressure, our screening comes to nothing. Then we may draw the following conclusions: the evolution of biological macromolecules in some respect depends on their surroundings and if they are too familiar with a certain environment, they may embody evolutionary inertia. 展开更多
关键词 Human Cu Zn SOD Directed evolution SCREENING
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牦牛血红细胞Cu Zn-SOD稳定性的研究 被引量:2
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作者 华绍烽 陈吉祥 +5 位作者 徐广峰 杨振土 王宇一 赵青云 张峰 苏普 《中国兽医科技》 CSCD 1992年第9期11-12,共2页
研究了牦牛血红细胞Cu、Zn-SOD的部分理化性质,结果表明其分子量、紫外吸收率与黄牛SOD的接近,而在Cu和Zn的含量方面存在较大差异。牦牛Cu、Zn-SOD对pH及温度的变化不敏感,但抗胰蛋白酶和抗H_2O_2的能力稍差。
关键词 CU Zn-SOD 稳定性 牦牛 红细胞
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hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白的制备、穿膜效应及其抗氧化、抗炎症功效
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作者 张洁 姚君妍 +4 位作者 杨英桂 王飞 郑清友 李欣 柳长柏 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1059-1069,共11页
目的 探究人源性细胞膜穿透肽hPP10携带人源性抗氧化蛋白Cu,Zn-SOD的穿膜效应并观察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技术扩增人源性SOD基因片段、酶切连接法构建重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD;利用镍柱亲和层析... 目的 探究人源性细胞膜穿透肽hPP10携带人源性抗氧化蛋白Cu,Zn-SOD的穿膜效应并观察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技术扩增人源性SOD基因片段、酶切连接法构建重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD;利用镍柱亲和层析法、分子筛方法纯化Cu,Zn-SOD、hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白并利用Western blotting法鉴定其正确性;利用免疫荧光法、荧光共定位实验、Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD在细胞中的穿膜效应;利用Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白穿膜时间梯度和浓度梯度效应;利用SOD酶活性测定试剂盒检测hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后的SOD酶活性;利用MTT法检测hPP10对细胞活性的影响。利用H2O2建立HEK293氧化应激细胞模型,通过流式细胞分析术(FCM)分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后细胞凋亡情况;并RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后凋亡相关因子的表达情况;通过ROS检测分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后抗氧化能力。TPA诱导建立小鼠耳部炎症模型(5只/组,共4组),然后RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后,NFκB,IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录情况;Western blotting检测NFκB p65、p-NFκB p65、IL-1β、TNFα基因的表达;免疫组化分析炎性因子p-NFκB p65、TNFα基因的表达。结果 成功构建了重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD,并获得Cu,Zn-SOD蛋白和hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白;免疫荧光试验结果表明5μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD转导HEK293细胞具有明显的穿膜效应;荧光共定位实验显示融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD入胞后定位在细胞膜内,部分蛋白定位在细胞核内;Western blotting实验结果表明hPP10-Cu,Zn-SOD转导Hela(P<0.05),HEK293(P<0.01)细胞具有浓度依赖性,细胞内hPP10-Cu,Zn-SOD存在可持续24 h;5μmol/L的hPP10-Cu,Zn-SOD转导细胞具有较好的抗氧化活性(P<0.01);MTT结果显示高达10μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD对于细胞活力的影响小。在氧化应激模型中,FCM结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞降低了细胞的早期凋亡(P<0.01)和晚期凋亡(P<0.05);RT-qPCR结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞使Bcl2、Mcl1、Deptor等抗凋亡因子升高(P<0.05),降低了Bad、P21、P27等促凋亡因子的表达(P<0.05);ROS结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞显著降低了细胞内的活性氧含量(P<0.01)。在炎症模型中,hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白可显著降低IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录(P<0.05);p-NFκB p65、IL-1β及TNFα的表达都呈现了抑制作用(P<0.05);hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白处理组较Cu,Zn-SOD蛋白处理组,降低了炎性因子p-NFκB p65及TNFα基因的表达(P<0.05)。结论 融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD具有明显的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效,且对细胞毒副作用很小。这些结果为hPP10作为新的递送载体奠定基础,也为hPP10-Cu,Zn-SOD应用于护肤品等提供了理论依据。 展开更多
关键词 人源性细胞膜穿透肽hPP10 铜锌超氧化物歧化酶Cu Zn-SOD 抗氧化 抗炎 酶活力测定
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人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性 被引量:3
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作者 迟春萍 隋红 +9 位作者 李雨桐 薛向光 王志武 牛灵 刘畅 王艳芳 吴晓娟 郭立君 盛军 李校堃 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第5期374-377,共4页
目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产... 目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。 展开更多
关键词 人Cu Zn-SOD基因 真核表达 毕赤酵母 稳定性
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丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析 被引量:11
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作者 朱海生 刘建汀 +6 位作者 陈敏氡 李永平 王彬 张前荣 叶新如 林珲 温庆放 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第17期3386-3399,共14页
【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu... 【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。 展开更多
关键词 丝瓜 褐变 Cu/Zn-SOD 表达分析 SOD活性
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Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达 被引量:11
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作者 姚冉 李轶女 +2 位作者 张志芳 沈桂芳 潘沈元 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期78-82,共5页
为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已... 为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。 展开更多
关键词 CU Zn-SOD基因 植物表达载体 转基因烟草
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人Cu,Zn-SOD在酵母系统中的表达 被引量:7
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作者 施惠娟 陈哲宇 +3 位作者 李明峰 魏东芝 吴祥甫 袁勤生 《华东理工大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期601-603,共3页
甲醇酵母 (Pichia pastoris)是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人 Cu,Zn- SOD基因克隆到酵母整合型质粒载体 p PIC3.5K,经转化 his4缺陷型酵母 GS1 1 5,用 MD培养基及 PCR方法筛选阳性转化子 ,并用含 G41 8的 YPD培养基筛选多拷... 甲醇酵母 (Pichia pastoris)是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人 Cu,Zn- SOD基因克隆到酵母整合型质粒载体 p PIC3.5K,经转化 his4缺陷型酵母 GS1 1 5,用 MD培养基及 PCR方法筛选阳性转化子 ,并用含 G41 8的 YPD培养基筛选多拷贝转化子 ,经甲醇诱导表达。 SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人 Cu,Zn- SOD,经计算机扫描分析 ,表达量占酵母可溶性蛋白的 1 4% ,所表达的人 Cu,Zn- SOD比活可达每毫克蛋白质 77U。 展开更多
关键词 人Cu Zn-SOD 甲醇酵母 基因表达 蛋白质印迹
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丹参铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆与生物信息学分析 被引量:15
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作者 纪砚耘 化文平 王喆之 《陕西师范大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期56-61,共6页
依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预... 依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预测和分析.结果表明,克隆得到的丹参Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD在序列组成、结构及活性位点等方面均有高度的相似性. 展开更多
关键词 Cu/Zn-SOD 降落PCR 丹参 生物信息学
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哈密瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及生物信息学分析 被引量:5
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作者 马伟荣 单春会 +1 位作者 童军茂 柳涛 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第13期181-185,190,共6页
依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定... 依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定所克隆的基因片段为哈密瓜的Cu/Zn-SOD基因序列。运用蛋白质分析软件分析结果表明,克隆得到的哈密瓜Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和β-折叠等蛋白质二级结构元件构成,同时与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD的组成成分和理化性质具有高度的相似性。 展开更多
关键词 哈密瓜 CU Zn-SOD 基因克隆
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荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证 被引量:5
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作者 练从龙 卢秉国 +4 位作者 赖钟雄 冯新 林玉玲 陈裕坤 张梓浩 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期16-22,共7页
以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、... 以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。 展开更多
关键词 荔枝古树 胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD3 启动子 功能验证
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锌对3-吗啉-斯得酮亚胺(SIN-1)诱导的人晶状体上皮细胞Cu/Zn-SOD表达及活性的影响 被引量:3
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作者 贾义 宋萍萍 +1 位作者 周静 钟乃凤 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2017年第1期24-27,共4页
目的研究补锌和缺锌条件下3-吗啉-斯得酮亚胺(SIN-1)对人晶状体上皮细胞铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)表达及活性的影响。方法将培养的SRA01/04细胞系分为6组:对照组、SIN-1处理组、补锌组、补锌联合SIN-1处理组、缺锌组和缺锌联合SIN-... 目的研究补锌和缺锌条件下3-吗啉-斯得酮亚胺(SIN-1)对人晶状体上皮细胞铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)表达及活性的影响。方法将培养的SRA01/04细胞系分为6组:对照组、SIN-1处理组、补锌组、补锌联合SIN-1处理组、缺锌组和缺锌联合SIN-1处理组。采用MTT法检测细胞存活率,Western blotting和Cu/Zn-SOD活性检测试剂盒分别检测Cu/Zn-SOD蛋白表达和活性水平的变化。结果我们选择对细胞存活率无显著影响的50μmol·L^(-1)ZnSO_4和1μmol·L^(-1)N,N,N,N-四-(2-吡啶基甲基)乙二胺作为补锌和缺锌的条件,选择对细胞存活率有显著影响的500μmol·L^(-1)SIN-1作为细胞受损的条件。在此条件下对照组、SIN-1处理组、补锌组、补锌联合SIN-1处理组、缺锌组和缺锌联合SIN-1处理组的细胞存活率分别为(100.0±1.4)%、(84.7±1.8)%、(101.2±1.6)%、(95.5±1.9)%、(100.9±2.3)%和(75.3±1.2)%,与对照组相比,SIN-1处理组和缺锌联合SIN-1处理组的细胞存活率均显著下降(均为P<0.05),与SIN-1处理组相比,补锌联合SIN-1处理组的细胞存活率显著升高(P<0.05),缺锌联合SIN-1处理组的细胞存活率则进一步下降(P<0.05)。各组的Cu/Zn-SOD蛋白相对表达量分别为1.005±0.007、0.991±0.015、1.044±0.008、0.945±0.007、1.278±0.011和0.850±0.057,Cu/Zn-SOD活性分别为(1.00±0.03)U、(0.85±0.05)U、(1.69±0.04)U、(1.35±0.05)U、(1.52±0.04)U和(1.09±0.03)U。与对照组相比,补锌组和缺锌组Cu/Zn-SOD蛋白表达量和活性均显著增加(均为P<0.05)。分别与补锌组或缺锌组相比,补锌联合SIN-1处理组和缺锌联合SIN-1处理组的Cu/Zn-SOD蛋白表达水平和活性均显著下降(均为P<0.05)。结论补锌可以通过上调Cu/Zn-SOD的表达水平和活性,保护人晶状体上皮细胞抵抗由SIN-1造成的损伤,可能对白内障的形成有抑制作用。 展开更多
关键词 人晶状体上皮细胞 铜锌超氧化物歧化酶
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小葱叶胞质中3种Cu·Zn-SOD的纯化及性质研究 被引量:12
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作者 唐双焱 邹国林 金建明 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第6期796-799,共4页
超氧化物歧化酶(SOD)是一种消除体内氧自由基损伤的重要因子,可分为CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD.作者在小白菜叶中曾发现5种SOD,已鉴别其中一种为Mn-SOD,来源于线粒体[1];其余4种为CuZn... 超氧化物歧化酶(SOD)是一种消除体内氧自由基损伤的重要因子,可分为CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD.作者在小白菜叶中曾发现5种SOD,已鉴别其中一种为Mn-SOD,来源于线粒体[1];其余4种为CuZn-SOD,其中2种分别来源于胞质[... 展开更多
关键词 小葱 Cu.Zn-SOD 纯化 性质
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高效hCu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能的研究 被引量:3
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作者 王晓勋 杞少华 +1 位作者 李瑞明 梁清乐 《分子诊断与治疗杂志》 2016年第2期88-93,共6页
目的探讨h Cu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能。方法首先,人工设计合成蛋白转导域序列(protein transduction domain,PTD),以人胚肝组织的总RNA为模板,逆转录扩增得人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列。其次,将此序列及人工合成... 目的探讨h Cu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能。方法首先,人工设计合成蛋白转导域序列(protein transduction domain,PTD),以人胚肝组织的总RNA为模板,逆转录扩增得人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列。其次,将此序列及人工合成PTD序列定向插入p ET16b载体;测序鉴定后,将构建成功的重组载体导入E.coli BL21菌株,异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,经镍柱纯化,洗脱液经SDS-PAGE检测。最后,将纯化产物与食管癌细胞(EC9706)共孵育,用激光共聚焦和流式细胞仪的方法检测蛋白穿膜能力及活性。结果测序结果与人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列相符;SDS-PAGE结果出现18.6 kd和20 kd的目的条带;激光共聚焦和流式细胞仪的方法显示蛋白可穿膜且保持活性。结论本实验成功构建了PET16b/h Cu,Zn-SOD-PTD原核表达质粒,可在大肠杆菌中稳定表达融合蛋白,融合蛋白具有穿膜且保持活性。 展开更多
关键词 蛋白转导域 人铜锌超氧化物歧化酶 生物膜 原核表达载体 内化作用
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miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达 被引量:2
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作者 周小龙 魏春阳 +8 位作者 黄佳 史艳梅 王皓 罗朝鹏 李锋 王燃 杨军 陈继峰 林福呈 《烟草科技》 EI CAS 北大核心 2014年第4期99-102,共4页
模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结... 模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。 展开更多
关键词 烟草 miRNA398 CU Zn-SOD基因
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玉米芯硫酸酯化多糖对荷瘤小鼠血浆Cu·Zn-SOD及MDA的影响 被引量:5
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作者 赵锐 梁铁彪 孟繁军 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期153-155,共3页
目的探讨玉米芯硫酸酯化多糖(CCCS)对荷瘤小鼠机体抗氧化作用及抗肿瘤机制的关系。方法采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法分别测定荷瘤小鼠血浆Cu.Zn-SOD活力和MDA含量。结果CCCS对荷瘤小鼠的抑制作用较显著(P<0.05)... 目的探讨玉米芯硫酸酯化多糖(CCCS)对荷瘤小鼠机体抗氧化作用及抗肿瘤机制的关系。方法采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法分别测定荷瘤小鼠血浆Cu.Zn-SOD活力和MDA含量。结果CCCS对荷瘤小鼠的抑制作用较显著(P<0.05),抑瘤率可达34%以上,其可以增加荷瘤小鼠血浆Cu.Zn-SOD活力(P<0.05),降低荷瘤小鼠血浆MDA的含量(P<0.05)。结论CCCS可以通过提高机体抗氧化能力而抑制肿瘤的生长。 展开更多
关键词 玉米芯硫酸酯化多糖(CCCS) Cu·Zn-SOD MDA 抗肿瘤 抗氧化
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耐热、高产重组人Cu,Zn-SOD改构体的构建及纯化方法的研究 被引量:2
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作者 张琨 张月娟 +3 位作者 王琰 张志敏 马晓迅 万一 《西北大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期837-842,共6页
目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu... 目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE分析改构体蛋白的表达,并进行W estern blot鉴定;研究改构体蛋白的纯化方法,HPLC检测蛋白纯度,比较rhCu,Zn-SOD及其改构体的活性和热稳定性。结果成功构建了rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser表达载体;SDS-PAGE显示rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser蛋白在BL21(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量占菌体蛋白总量的64.6%;Western blot结果显示表达产物可以特异性地与小鼠抗人SOD多克隆抗体结合;纯化得到纯度大于95%的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Se改构体蛋白,从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍;改构体的热稳定性较未改构体获得大幅提高。结论构建的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser改构体具有较好的热稳定性和较高的活性产量,摸索出一种比较简易的蛋白纯化工艺,为Cu,Zn-SOD的广泛应用奠定基础。 展开更多
关键词 重组人Cu Zn-SOD 定点突变 纯化 热稳定性
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半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达及酶活性研究 被引量:1
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作者 郑嫩珠 章琳俐 +4 位作者 李丽 辛清武 缪中纬 朱志明 黄一帆 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期933-938,共6页
【目的】首次对半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达、酶活性进行研究,以期了解半番鸭不同组织抗氧化特性,为深入研究半番鸭对环境因子的响应能力及相关分子机制提供参考。【方法】通过实时荧光定量法、黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分... 【目的】首次对半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达、酶活性进行研究,以期了解半番鸭不同组织抗氧化特性,为深入研究半番鸭对环境因子的响应能力及相关分子机制提供参考。【方法】通过实时荧光定量法、黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分别测定了半番鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌胃和胸肌中的Cu/Zn-SOD mRNA相对表达量、酶活力和MDA含量。【结果】Cu/Zn-SOD mRNA在胸肌中相对表达量最高,总体趋势为胸肌>肝脏>肺>心脏>脾脏>肾脏/肌胃。酶活力测定结果显示,肝脏和肾脏Cu/Zn-SOD酶活力显著高于胸肌和肌胃。半番鸭胸肌MDA含量显著高于肝脏、肌胃和肾脏,提示胸肌可能更易受到氧化应激损伤。相关分析结果显示Cu/Zn-SOD活力与MDA含量呈显著负相关,而抗氧化酶活力与mRNA表达水平相关性不显著。【结论】半番鸭Cu/Zn-SOD基因表达和酶活力具有组织特异性。不同组织Cu/Zn-SOD活力差异可能与Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及组织代谢水平有关。 展开更多
关键词 Cu/Zn-SOD MRNA表达 酶活力 半番鸭
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鹅红细胞Cu,Zn-SOD分离纯化及部分性质的研究 被引量:1
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作者 张兰杰 辛广 +1 位作者 张维华 袁勤生 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第12期86-89,共4页
经氯仿-乙醇分级分离,丙酮沉淀及DE-32纤维素柱层析的方法,从鹅红细胞中得到纯化的Cu,Zn-SOD。结果表明此酶的比活力为10656.14U/mg,提纯倍数为354.73,聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白带与活性带相对应。相对分子量约为32000,相对亚基分子量约为... 经氯仿-乙醇分级分离,丙酮沉淀及DE-32纤维素柱层析的方法,从鹅红细胞中得到纯化的Cu,Zn-SOD。结果表明此酶的比活力为10656.14U/mg,提纯倍数为354.73,聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白带与活性带相对应。相对分子量约为32000,相对亚基分子量约为16000。最大紫外吸收波长为258nm,对KCN和H2O2敏感,最适pH为6~9,热稳定性在60℃以下。 展开更多
关键词 鹅红细胞 CU ZN-SOD 纯化 性质
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构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究 被引量:1
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作者 迟春萍 时成波 +10 位作者 曹玉锋 陈子杨 徐军 张健锋 贾媛 李铮 王小杰 牛灵 田海山 孙彪 李校堃 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第5期218-223,共6页
设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷... 设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2~8倍,活性检测显示提高2~4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。 展开更多
关键词 毕赤酵母GS115 Cu Zn-SOD 电转化法 高拷贝 真核表达
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猪血Cu,Zn-SOD的分离纯化 被引量:5
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作者 陈艺虹 张志群 +1 位作者 王兰 徐国华 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2004年第2期58-59,共2页
用加热变性、盐析和凝胶过滤层析的方法从猪血中提取分离出有多种生理活性的Cu ,Zn SOD ,经过分析得知 ,其比活为 1 0 0 3 5u/mg、分子量为 3 1 70 0u的电泳纯单组分。
关键词 猪血 CU ZN-SOD 分离纯化 盐析 凝胶过滤 超氧化物歧化酶 血红细胞
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