杨梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(MrSOD1)cDNA的克隆及表达分析

以杨梅叶为材料,利用RT-PCR技术克隆Cu/Zn超氧化物歧化酶基因,并利用半定量RT-PCR方法分析该基因在不同组织中的表达。获得1个杨梅Cu/ZnSOD基因编码区全长cDNA序列,长度为461bp,编码一个由152个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质具有Cu/ZnSOD的特征信号序列;序列同源性分析表明,其与GenBank中注册的Cu/ZnSOD序列的同源性均在77%以上。该基因命名为MrSOD1(GenBank登录号:GQ404510)。半定量RT-PCR分析显示,MrSOD1在4种组织中表达量为:果>叶>花>枝条。本试验为进一步研究MrSOD1的时空表达特性、调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠定基础。

饮食和运动干预对2型糖尿病大鼠骨骼肌Cu/ZnSOD mRNA表达的影响

目的:探讨饮食和运动对糖尿病大鼠骨骼肌细胞Cu/ZnSODmRNA表达及其血浆酶活性的影响。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠24只采用高糖高脂饮食后腹腔注射小剂量链脲霉素,建立糖尿病模型,随机分为4组:糖尿病高脂饲料非运动组(DFN,n=6),糖尿病常规饲料非运动组(DRN,n=6),糖尿病常规饲料低强度运动组(DRL,n=6),糖尿病常规饲料高强度运动组(DRH,n=6)。活动平板进行耐力训练8周,测定骨骼肌Cu/ZnSODmRNA和血浆Cu/ZnSOD活性的变化。结果:两运动组骨骼肌Cu/ZnSODmRNA表达显著高于DFN组和DRN组,两运动组之间无显著差异。两运动组血浆Cu/ZnSOD活性显著高于DFN组和DRN组,DRN组血浆Cu/ZnSOD活性显著高于DFN组。结论:饮食调整加运动训练可以促进糖尿病大鼠骨骼肌Cu/ZnSODmRNA表达,提高Cu/ZnSOD酶活性,而运动强度对此无显著影响。

重组人超氧化物歧化酶的基因克隆、表达及产物纯化研究

为了克隆人SODcDNA ,构建表达载体 ,实现其在大肠杆菌中的高效稳定表达 ,通过抽提人肝组织总RNA ,RT PCR扩增人SODcDNA ,构建含rhSODcDNA的表达质粒pLY 4/rhSOD ,转化大肠杆菌JF112 5进行表达研究。结果克隆到的rhSODcDNA序列与文献报道一致 ,在宿主菌中获得高效表达 ,表达水平达 6 8%以上 ;蛋白复性纯化工艺高效快速 ,rhSOD纯品纯度达 98%以上 ,比活性达到 2 5 2 9u/mg ;

原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建

目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。

水稻Cu/Zn-SOD基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻铜锌超氧化物岐化酶基因(OsCu/Zn-SOD)的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa japonica)为材料,采用同源克隆法获得OsCu/Zn-SOD,并对其进行表达及生物信息学分析。结果表明,OsCu/Zn-SOD基因cDNA序列为606 bp,编码152个氨基酸,CDS区459 bp,碱基组成A为22.7%、T为24.4%、G为29.4%、C为23.5%。OsCu/Zn-SOD蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位OsCu/Zn-SOD主要分布在细胞质中,推测可能在翻译、运输结合和能量代谢过程中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在8个丝氨酸磷酸化,4个苏氨酸磷酸化位点。进化分析表明,克隆的OsCu/Zn-SOD氨基酸序列与玉米、短柄草的同源关系较近,具有较高的保守性,与小立碗藓的同源关系较远。RT-PCR分析表明,OsCu/Zn-SOD基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和穗,根中表达量最低。本研究为进一步研究OsCu/Zn-SOD在水稻抗逆中的作用提供了重要的帮助。

突变的人铜、锌超氧化物歧化酶基因的克隆、测序及表达

目的：通过基因工程的方法将ｒｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ基因改造以得到更加稳定的酶。方法：以本实验室构建的 ｒｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ为模板，利用含有突变核苷酸的引物进行 ＰＣＲ扩增，将正确测定的含 ｒｈＣｕ， Ｚｎ－ＳＯＤ突变（ｒｈＣｕ，Ｚｎ－ＭＳＯＤ）基因的重组质粒重组到表达载体ＰＥＴ－２２ｂ（＋）中，重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达ｒｈＣｕ，Ｚｎ－ＭＳＯＤ。结果：表达产物占菌体总蛋白的３８％，具有特异性ＳＯＤ酶活性。结论：从基因突变的角度改善酶的性能不仅具有理论意义，又有一定的实用价值。

荔枝铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与序列分析

以“三月红”荔枝基因组 DNA为模板 ,用 Cu· Zn SOD基因特异寡聚核苷酸为引物 ,进行 PCR扩增 ,得到特异基因片段 ,将其克隆到 p GEM T载体上 ,转化感受态大肠杆菌 TG1中 ,对转化子中重组p GEM T上的 Cu·Zn SOD基因片段的 PCR扩增检测和序列分析 ,表明克隆成功 ;该基因片段有 4 78个核苷酸 ,由 4个外显子和 3个内含子组成 ;外显子由 2 3 4个核苷酸组成 ,编码 78个氨基酸 ;该基因片段编码的氨基酸序列与水稻、玉米、番茄、大白菜和松树的 Cu· Zn SOD基因编码的氨基酸序列的同源性分别为79.5%、 73 .1 %、 73 .1 %、 71 .8%和 75.7%。

pGBKT7-hSOD1cDNA重组质粒的构建及鉴定

目的构建pGBKT7-hSOD1cDNA重组质粒并进行鉴定。方法采用基因克隆技术克隆目的基因片段,利用基因重组技术构建pGBKT7-hSOD1cDNA重组质粒。结果重组质粒经双酶切鉴定,目的基因已与载体连接。重组质粒测序结果经BLAST比对,与已知目的基因序列及载体序列相符,证实了重组质粒构建的正确性。结论重组质粒hSOD1cDNA-pGBKT7构建成功。

人铜锌超氧化物歧化酶的基因工程研究 Ⅱ.人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达

利用pUC 8为载体质粒,将合成的人Cu/Zn SOD基因置于Lac Z启动子的调控下,构建了含有该基因的表达质粒pCZS Ⅰ。首次成功地在大肠杆菌中表达了合成人Cu/Zn SOD的基因。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳薄层扫描分析证明,SOD基因的表达产物占细胞可溶性蛋白质的13％左右,用光扩增法捡测表达产物的酶活性,每毫克蛋白质为48.6 McCord Fridovich单位。

桑螟胞外铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与融合表达及重组蛋白酶活性检测

桑螟（Glyphodes pyloalis）是蚕区桑园的主要害虫之一,鉴定其抵御各种环境胁迫相关的基因,是制定防治新策略的重要理论依据。对桑螟幼虫转录组数据的分析中,发现桑螟胞外铜锌超氧化物歧化酶（ec Cu/Zn SOD）基因在应对高温胁迫时的表达量发生显著变化。为了明确ec Cu/Zn SOD在桑螟应对不良环境中发挥的作用,克隆和鉴定了其编码基因Gpec Cu/Zn SOD（Gen Bank登录号：MG566057）。Gpec Cu/Zn SOD基因的开放阅读框长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白质序列与脐橙螟（Amyelois transitella）的一种SOD蛋白基因（Gen Bank登录号：XP_013197347.1）编码氨基酸序列的一致性高达83%。采用邻近相接法构建桑螟与其他昆虫的Cu/Zn SOD系统发生树,结果显示Cu/Zn SOD被分为ec Cu/Zn SOD和ic Cu/Zn SOD两类,主要是随物种进化而进化。采用半定量RT-PCR检测不同温度处理桑螟5龄幼虫的Gpec Cu/Zn SOD基因表达情况,结果显示幼虫体内的Gpec Cu/Zn SOD在高温（40℃）和低温（4℃）条件下表达量最高。构建p Cold-Gpec Cu/Zn SOD重组表达质粒,并在大肠埃希菌中实现异源表达。利用镍柱亲和层析法分离纯化重组Gpec Cu/Zn SOD蛋白,采用WST-1法测定重组Gpec Cu/Zn SOD蛋白在40℃时的酶活性最高,并且经60～70℃处理后仍然具有较高的酶活性。采用牛津杯法分析重组Gpec Cu/Zn SOD的抗氧化活性表明：过表达Gpec Cu/Zn SOD的大肠埃希菌抗氧化的能力显著增强,显示Gpec Cu/Zn SOD具有较强的抗氧化功能。研究结果暗示Gpec Cu/Zn SOD在桑螟应对高温胁迫过程中发挥着重要作用。

人铜锌超氧化物歧化酶的基因工程研究——Ⅰ.人铜锌超氧化物歧化酶基因的合成与克隆

本文报道人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide Dismutase, SOD)基因的合成与克隆。采用大肠杆菌偏爱密码子,按入Cu/Zu SOD一级结构顺序编码。基因全长495个碱基对,合成时,分成26个基因片段分别合成。采用分级退火的方法,在T4 DNA连接酶作用下,将基因片段组装成完整的基因,经序列分析证明,合成的基因顺序与设计一致。

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。