徐长卿中的天然产物XCQ-9对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的探讨徐长卿中天然产物XCQ-9抑制人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖和凋亡的作用及可能机制。方法以Jurkat细胞作为白血病细胞模型,采用MTT法测定0(空白对照)、2.5、5、10、20、40μmol/L XCQ-9作用24、48、72 h后对Jurkat细胞增殖的抑制作用。用0(空白对照)、2.5、5、10μmol/L XCQ-9作用于Jurkat细胞24、48 h后,利用流式细胞术分析XCQ-9对细胞周期和细胞凋亡的影响,并通过Western blot实验检测上述药物作用24 h后细胞中胱天蛋白酶9(Caspase-9)、活化的Caspase-9(Cleaved Caspase-9)、Caspase-3、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、活化的PARP(Cleaved PARP)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)的表达情况。结果与空白对照比较,不同浓度XCQ-9均可显著降低Jurkat细胞的存活率(P<0.01),并呈时间和浓度依赖性趋势。5、10μmol/L XCQ-9作用48 h后均可显著诱导Jurkat细胞凋亡(P<0.05或P<0.01),将细胞周期阻滞在G2期(P<0.01)。10μmol/L XCQ-9作用24 h后,可显著下调细胞中CDK1、Caspase-9蛋白的表达(P<0.01),上调细胞中Cyclin B1、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论XCQ-9通过诱导G2期阻滞抑制Jurkat细胞增殖,并激活Caspase通路促进细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。

砷在体外对人T淋巴细胞和Jurkat T细胞系的生长抑制作用

目的:通过三氧化二砷在体外对人 T淋巴细胞生长的影响 ,探讨三氧化二砷的免疫毒性和免疫抑制作用的机制。 方法 :应用正常人外周血 T细胞和人 Jurkat T细胞作为体外实验模型 ,观察不同浓度 (0 .5～ 10 0μM)三氧化二砷对正常人淋巴细胞和人 Jurkat T细胞的生长影响 ,并用电镜观察三氧化二砷对人 Jurkat T细胞的形态学改变。结果 :体外实验结果显示 ,三氧化二砷在 0 .5～ 10 0 μM浓度范围对正常人 T细胞和人 Jurkat T细胞的生长有明显的抑制作用 ,并随着三氧化二砷的浓度增高而抑制作用增强 ,呈现为剂量 -反应关系。三氧化二砷对正常人 T淋巴细胞和人 Jurkat T细胞的 IC50 分别为 8.0 5 μM和 8.9μM。电镜观察结果提示 ,三氧化二砷 (5 μM,2 4 h)处理 Jurkat T细胞 ,导致较多细胞出现细胞体积缩小 ,细胞核内染色质浓集于核膜内面成团块状 ,或染色体断裂成碎块状 ,或胞核固缩边缘化等典型的凋亡细胞特征性形态改变。存活的部分细胞线粒体增生 ,提示细胞功能活跃。同时 ,见到许多细胞浆内有空泡形成。结论 :三氧化二砷在体外能明显地抑制人 T淋巴细胞生长 ,这种生长抑制作用的机制之一是诱导细胞凋亡 。

砷诱导Jurkat T淋巴细胞铁蛋白重链的表达

目的了解三氧化二砷诱导人JuikatT淋巴细胞的差异表达基因,探讨砷对淋巴细胞基因转录的影响机制。方法在体外用三氧化二砷(5μmol/L,24h)处理人JurkatT淋巴细胞后,应用抑制性消减杂交技术(SSH)和基因克隆技术构建差异表达的cDNA文库,用PCR技术和测序技术鉴定阳性克隆。结果用SSH技术构建了由三氧化二砷诱导的人JurkatT淋巴细胞的差异表达基因的正向消减cDNA文库。经测序分析结果显示,铁蛋白重链在正向消减cDNA文库中有2个阳性克隆。结论三氧化二砷可诱导铁蛋白重链的表达,铁蛋白重链在淋巴细胞抗砷损伤机制中可能起着一定的作用。

白藜芦醇诱导人T淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的研究

用荧光染色、透射电镜、Wright-Giemsa染色方法检测人T淋巴瘤Jurkat细胞在白藜芦醇(resveratrol,Res)诱导凋亡时的形态学变化情况,并用流式细胞仪对其进行定量分析,West blot检测部分凋亡信号分子分泌的变化情况.发现白藜芦醇能明显诱导该细胞凋亡,显现出典型的凋亡现象,且凋亡有明显的药物依赖性.流式细胞仪检测发现,各药物处理组(0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μL/mL)的凋亡率(3.01%,8.93%,17.97%,22.45%,32.88%)和对照组的凋亡百分率(0.91%)比较有显著性差异.West Blot检测则发现,Res降低了bcl-xl,bax的表达,以至不能进一步产生bcl-2/bax和bcl-2/bcl-xL二聚体来抑制细胞凋亡,即减除了这些凋亡抑制因子对细胞凋亡的抑制,从而使细胞顺利进入caspase介导的凋亡途径.

砷诱导人T淋巴细胞表达HMG2基因的克隆研究

目的 为了解三氧化二砷诱导人T淋巴细胞的差异表达基因 ,探讨砷对淋巴细胞基因转录的影响机制。方法 在体外用三氧化二砷处理人JurkatT淋巴细胞 ( 5 μmol/L ,2 4h)后 ,应用抑制性消减杂交技术 (SSH)和克隆技术构建差异表达的cDNA文库 ,用PCR技术和测序技术鉴定阳性克隆。结果 用SSH技术构建了由三氧化二砷诱导的JurkatT淋巴细胞的差异表达基因的正向消减cDNA文库。经测序分析结果显示 ,该文库中含有高泳动类蛋白 2 (HMG2 )基因片段 ,同源性 98%。结论 我们的研究结果提示三氧化二砷 ( 5 μM ,2 4h)可诱导HMG2的转录 。

CA6感染对人JurkatT细胞Toll样受体表达的影响

目的观察柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CA6)在人JurkatT细胞中的感染特点,并检测感染后Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)的表达及细胞因子分泌情况,从而探索CA6的感染和致病机制。方法选取人Jurkat T细胞建立CA6病毒细胞感染模型,检查病毒感染引起的细胞形态学改变。采用RT-PCR方法检测不同感染时间后TLR1~TLR10mRNA表达情况,并利用Real-TimePCR方法进一步分析细胞中TLRs的动态表达谱;采用ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素6(IL-6)白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。结果CA6可在人JurkatT细胞中复制增殖并引起细胞病变效应;RT-PCR结果提示,CA6感染引起人JurkatT细胞TLR7的表达上调;Real-TimePCR检测结果显示,感染6h、12h、24h和48h后,感染组TLR7mRNA的相对表达水平分别为1.69±0.473.53±1.174.46±0.69和2.76±0.39,与对照组结果差异有统计学意义(t值分别为-2.53、-3.74、-8.64、-7.75,P值分别为0.112、0.02、0.001、0.001);细胞因子检测结果提示,CA6感染后IL-8的分泌上调,明显高于对照组24h和48h的分泌水平,差异有统计学意义(t值分别为-49.75、-91.10,P值<0.05)。结论CA6病毒感染人JurkatT细胞后引起TLR7表达上调,其诱导的炎性反应与部分TLR介导的信号转导途径可能有关。

苯代谢物氢醌促进人T细胞白血病细胞自噬的研究

目的探讨苯代谢物氢醌(hydroquinone,HQ)对人T细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)自噬水平的影响及其作用机制。方法取对数生长期的Jurkat细胞,分别暴露于含终浓度为0(对照)、6.25、12.5、25、50μmol/L HQ的培养基处理24 h。采用单丹黄酰尸胺(MDC)染色法检测Jurkat细胞内自噬囊泡的生成;通过透射电子显微镜观察Jurkat细胞内自噬体的超微结构;采用Western blot法检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B(LC3B)、P62蛋白及经典的自噬调节通路磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路中人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源等位基因(PTEN)、Akt与磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达情况。结果 Jurkat细胞内MDC荧光强度随着HQ浓度的升高而增强,在胞浆中呈点状分布。HQ染毒组Jurkat细胞出现较多的双层膜自噬体结构,伴有线粒体明显肿胀,内质网扩张等超微结构的改变。与对照组比较,各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平及6.25、12.5μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内P62蛋白的表达水平均较高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平均呈上升趋势,而P62蛋白的表达水平呈先上升后下降的趋势。与对照组比较,12.5、25、50μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平均较高,而各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内p-Akt蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P<0.05);但各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内Akt蛋白的表达水平均无明显改变(P>0.05)。且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平呈上升趋势,p-Akt蛋白的表达水平呈下降趋势。结论 HQ可促进Jurkat细胞内自噬水平的增加,其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。

一种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法的建立

目的建立基于人白血病T细胞株Jurkat的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte immunoglobulin,ALG)淋巴细胞毒效价定量检测方法,并进行验证。方法采用人Jurkat细胞作为靶细胞,抗人T细胞兔免疫球蛋白(商品名:Grafalon)作为待检样品,建立其淋巴细胞毒效价定量检测方法。优化反应体系,考察细胞培养密度、细胞代次对待检样品效价的影响,并对方法的精密度进行验证。结果优化的反应体系组成为50μL待检样品+50μL补体(1∶5稀释)+50μL细胞(5×10^(6)个/mL);细胞传代密度为2×10^(5)个/mL传代培养72 h或3×10^(5)个/mL传代培养48 h用于效价测定最佳;当细胞生长状态较好且一致时,从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致。采用该方法板内重复测定待检样品效价,变异系数(CV)为6.32%,重复性良好;不同代次Jurkat细胞测定待检样品效价6次,CV为4.15%,中间精密度良好。结论建立了一种便捷、精确的测定ALG淋巴细胞毒效价的定量检测方法,为ALG效价测定提供了一种客观、准确的评价手段。