人LDHA原核表达载体的构建、蛋白纯化及活性鉴定

目的构建带GST标签的人乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)基因原核表达载体并纯化GST-LDHA融合蛋白,为进一步研究该基因在肿瘤中的作用作准备。方法以人乳腺文库为模板,通过PCR扩增LDHA基因片段;利用EcoRⅠ及HindⅢ酶切带GST标签的载体及LDHA基因PCR产物,并连接形成GST-LDHA重组质粒进行测序; GST-LDHA重组质粒转化入Rossate感受态,并加入合适比例的IPTG进行小量诱导,通过Western印迹检测GST-LDHA蛋白表达;诱导成功的GST-LDHA重组质粒转化入Rossate感受态细胞进行大量增菌,IPTG诱导蛋白表达,利用GST琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化GST-LDHA蛋白,并用考马斯亮蓝染色检测,获得纯度较好的蛋白。结果获得大小约1000 bp的LDHA基因; GST-LDHA重组质粒构建成功;诱导GST-LDHA融合蛋白的表达并纯化获得纯度较好的融合蛋白。结论成功获得带GST标签的人LDHA基因的原核表达产物,为进一步研究LDHA在肿瘤中的作用奠定了基础。

人LDHA基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步研究。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人LDHA基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体上,经双酶切和测序鉴定成功后转染到肝癌HepG2细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,免疫荧光检测其亚细胞定位,并利用生长曲线、克隆形成以及划痕实验探究LDHA对肝癌HepG2细胞增殖、迁移能力的影响。结果从人乳腺文库中扩增获得大小约为1000 bp的DNA片段,并成功克隆至pEGFP-C1载体上,经测序与目的序列完全一致;转染肝癌HepG2细胞后目的基因成功表达;荧光显微镜观察发现,GFP-LDHA融合蛋白主要聚集于细胞质中;细胞生长曲线和克隆形成实验结果显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞增殖能力增强;划痕实验显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞迁移性增强。结论成功构建了带GFP标签的人LDHA真核表达载体,为进一步研究LDHA在肝癌细胞中的功能奠定了基础。