稳定表达MRG15基因的人晶状体上皮细胞株的建立

目的:克隆人15号染色体上死亡相关因子(MORF4-re-latedgeneonchromosome15,MRG15)基因的编码区全长,构建真核表达载体,建立稳定表达MRG15的人晶状体上皮细胞株,为MRG15在年龄相关性白内障(agerelatedcataract,ARC)发生中相关功能的研究奠定基础。方法:采用RT-PCR由人ARC晶状体前囊膜标本中扩增MRG15的编码区全长,克隆至pMD18-T载体并测序,结果正确后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用脂质体法对培养人晶状体上皮细胞进行稳定转染,挑取单克隆,用Westernblot进行MRG15表达的鉴定。结果:测序证实,由ARC晶状体前囊膜中扩增出的MRG15编码区全长序列正确。重组质粒pcDNA3.1(+)-MRG15经酶切后释放出与理论长度相符的片段。培养人晶状体上皮细胞稳定转染挑取单克隆后,经Westernblot检测,30个克隆中有19个MRG15的表达量明显增高。结论:克隆了人MRG15的编码区全长,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-MRG15,并建立了稳定表达MRG15的人晶状体上皮细胞株。

人MRG15基因荧光真核表达载体的构建及其在培养人晶状体上皮细胞的表达

目的克隆人MRG15(MORF4-related-gene on chromosome15)的编码基因,构建荧光表达载体,并检测其在培养人晶状体上皮细胞中的表达,为研究MRG15与年龄相关性白内障(age related cataract,ARC)的相关性奠定基础。方法用RT-PCR的方法从人ARC的晶状体前囊膜中扩增MRG15的编码基因,克隆至pMD18-T载体并测序,结果正确后亚克隆至荧光真核表达载体pEGP-N2中,酶切鉴定正确后采用脂质体法,瞬时转染培养人晶状体上皮细胞,荧光显微镜下检测MRG15-pEGP-N2的定位。结果测序证实,从人ARC晶状体前囊膜中扩增出的MRG15编码基因的序列及读框全部正确。重组质粒MRG15-pEGP-N2经酶切后产生与理论预期长度相符的片段。脂质体法转染后24h,观察到其主要在培养人晶状体上皮细胞的细胞核中表达。结论克隆了人MRG15的编码基因,成功构建了荧光真核表达载体MRG15-pEGP-N2,并可在培养人晶状体上皮细胞中表达。