人线粒体转录终止因子2基因启动子区的生物信息学分析

人线粒体转录终止因子2基因(mitochondrial transcription termination factor 2,MTERF2)在线粒体基因表达、细胞能量代谢及细胞周期调控过程中发挥重要作用,但MTERF2基因自身的表达调控机制仍不明确。通过生物信息学方法预测和分析人线粒体转录终止因子2基因启动子区的结构与功能,结果显示:人MTERF2基因全长9876 bp,含有3个外显子和2个内含子。基因上游5’端2500 bp的核苷酸序列存在3个启动子,启动子区序列中存在长为874 bp的CpG岛,启动子区共发现244个转录因子结合位点。人MTERF2基因启动子区的生物信息学分析,提高了针对该基因启动子的研究效率,并为分析基因启动子的功能奠定了重要的理论基础。

人MTERF2基因特异性shRNA载体的构建与干扰效果评价

[目的]构建针对人线粒体转录终止因子2(mitochondrial transcription termination factor 2,MTERF2)的shRNA干扰表达载体,检测其对人宫颈癌HeLa细胞MTERF2基因表达的干扰效率。[方法]以人MTERF2基因为靶向,设计并合成的2条互补寡核苷酸链克隆至pSilencer^(TM)4.1-CMV neo真核表达载体中得到重组干扰质粒。对重组质粒进行PCR和DNA测序鉴定;运用脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;采用半定量RT-PCR检测2个干扰质粒对人MTERF2基因mRNA表达的干扰效果,并筛选最有效的shRNA干扰序列;采用Western Blot技术检测2个干扰质粒转染HeLa细胞后MTERF2蛋白的表达情况。[结果]经PCR鉴定和DNA测序鉴定证实,pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2重组shRNA干扰表达质粒中已插入目的 DNA片断。瞬时转染MTERF2-shRNA的HeLa细胞48 h后,pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2干扰表达质粒均可以显著地降低人MTERF2基因mRNA和蛋白质的表达(P<0.01),而且pSiMTERF2-2干扰效果优于pSi-MTERF2-1。pSi-MTERF2-2对MTERF2基因mRNA和蛋白质表达的抑制率分别为74.0%、78.2%。[结论]成功构建针对人MTERF2基因的shRNA真核表达载体有效抑制目的基因的表达,为进一步应用于宫颈癌的基因治疗研究奠定了基础。