利用小鼠皮下人乳腺癌移植瘤模型观察MUC1-MBP抗乳腺癌作用

目的建立小鼠皮下人乳腺癌移植瘤模型,探讨MUC1-MBP蛋白疫苗的抗人乳腺癌作用。方法首先通过筛选最佳条件建立小鼠皮下人乳腺癌移植瘤动物模型,HE染色和免疫组化鉴定。利用已经建立的乳腺癌动物模型,通过肿瘤预防实验和治疗实验,观察MUC1-MBP抗人乳腺癌作用。结果通过5 Gy X射线照射,皮下注射MCF-7人乳腺癌细胞3×10~6个/只,FTY720灌胃4～6 d,成功建立小鼠皮下人乳腺癌移植瘤动物模型。在预防乳腺癌生长实验中,PBS对照组、MBP组和MUC1-MBP组小鼠成瘤率分别为100%、83%和67%,肿瘤平均体积分别为(91.9±56.3)mm^3、(22.3±21.5)mm^3和(17.2±18.0)mm^3。与对照组相比,MUC1-MBP组显著减小(P<0.001),MBP组明显减小(P<0.05),提示MUC1-MBP能明显预防乳腺癌生长,MBP对乳腺癌生长也有一定的预防作用。在治疗乳腺癌生长实验中,PBS对照组、MBP组和MUC1-MBP组小鼠肿瘤生长抑制率分别为0、17%和17%,肿瘤平均体积分别为:(101.7±73.6)mm^3、(56.9±56.7)mm^3和(32.6±32.3)mm^3,与对照组相比,MUC1-MBP组明显减小(P<0.05),差异显著,提示MUC1-MBP对乳腺癌具有治疗作用。MBP组无显著差异(P>0.05),无统计学意义,提示MUC1-MBP对乳腺癌具有治疗作用。肿瘤组织HE染色结果发现,MUC1-MBP和MBP免疫组小鼠肿瘤组织周围及癌细胞间淋巴细胞浸润较PBS组明显增多。结论成功建立ICR小鼠皮下人乳腺癌移植瘤模型,该模型为肿瘤疫苗活性研究提供良好的研究工具。利用该模型发现MUC1-MBP免疫明显抑制小鼠皮下人乳腺癌的生长,MBP免疫也具有一定的抗乳腺癌生长作用,其能明显增强MUC1的免疫原性。

基因工程鼠Muc1-MBP融合蛋白的制备及其免疫活性测定

目的：制备鼠Muc1-MBP融合蛋白,探讨其免疫活性。方法：将pMAL-Muc1转化大肠杆菌,通过IPTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定Muc1的表达,Amylose resin亲和层析纯化Muc1-MBP。将Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清Muc1特异性抗体的水平;MTT法测定小鼠抗Muc1特异的CTL活性;ELISPOT法测定脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌。结果：获得稳定表达Muc1的菌株,制备了分子量67 kD较纯的Muc1-MBP融合蛋白。Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠产生高效价Muc1特异抗体,效价在8 000~16 000之间,Muc1-MBP融合蛋白可诱导CTL杀伤活性,对人乳腺癌MCF-7和小鼠Lewis肺癌LLC1靶细胞的杀伤率分别为（74.5±5.9）%和（60.5±10.4）%,与对照组比P〈0.05,差异显著;Muc1-MBP融合蛋白免疫可诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,特异性活化Th1细胞。结论：成功制备重组鼠Muc1-MBP融合蛋白,其不仅能诱导特异体液免疫应答,而且可诱导细胞免疫应答,尤其能诱导对人类MCF-7细胞较小鼠Lewis肺癌LLC1细胞更加强烈的CTL杀伤活性,提示异种同源蛋白疫苗具有比同源蛋白疫苗更好的抗肿瘤作用。

重组人MUC1-MBP融合蛋白诱导小鼠Th1活化

目的检测重组MUC1-MBP融合蛋白对小鼠Th1细胞的活化作用。方法通过生物活性法测定MUC1-MBP免疫鼠脾细胞培养上清液中IL-2I、FN和血清中TNF水平;通过免疫组织化学染色法检测CD4+T细胞在肿瘤组织中的浸润。结果MUC1-MBP免疫鼠脾细胞分泌IL-2和IFN及血清TNF水平较对照组明显增高;MUC1-MBP诱导小鼠CD4+T细胞在肿瘤组织中浸润。结论重组人MUC1-MBP融合蛋白可激活小鼠Th1细胞。

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。

超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价

目的:评价超滤技术去除纯化后重组MUC1-MBP融合蛋白(MUC1-MBP)溶液中内毒素的效果,阐明超滤技术对去除内毒素的作用。方法:选取表达MUC1-MBP大肠杆菌基因工程菌,分别通过CM Sepharose FF离子交换层析(CM)(CM组)、CM联合Phenyl Sepharose 6FF疏水层析(C6)(CM+C6组)、CM加超滤(CM+超滤组)以及CM联合C6加超滤(CM+C6组+超滤)进行纯化,并去除内毒素;采用SDS-PAGE分析蛋白纯度;鲎试剂显色基质法检测内毒素表达水平。结果:SDS-PAGE分析,在预期相对分子质量62 000处呈现单一条带,Quantity One分析纯度>96%;CM组与CM+C6组内毒素表达水平均较高,但2组比较差异无统计学意义(P>0.05);与CM组比较,CM+超滤组内毒素表达水平明显降低(P<0.01);与CM+C6组比较,CM+C6超滤组内毒素表达水平明显降低(P<0.01);CM+超滤组与CM+C6+超滤组内毒素表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CM或CM联合C6均不能有效去除内毒素,其中C6对去除内毒素几乎无作用;CM加超滤可有效去除内毒素,超滤技术在去除内毒素中发挥重要作用。

重组MUC1-MBP融合蛋白联合R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用

目的:研究MUC1-MBP联合TLR7/8激动剂R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用,为寻找重组MUC1-MBP融合蛋白的合适佐剂提供实验依据。方法:21只C57BL/6小鼠随机分为对照组(注射生理盐水)、MUC1-MBP+R848组(注射MUC1-MBP+R848)和MUC1-MBP+卡介苗(BCG)组(注射MUC1-MBP+BCG),每组7只。第2次免疫后第4~7天无菌取脾脏组织,测定脾指数;淋巴细胞增殖反应测定各组小鼠的刺激指数(SI);ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清中肿瘤坏死因子γ(TNF-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平;流式细胞术检测小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群比例。结果:与对照组比较,MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠脾指数均升高(P<0.01),SI升高(P<0.05),TNF-γ水平升高(P<0.05或P<0.01);且MUC1-MBP+R848组小鼠上述指标高于MUC1-MBP+BCG组(P<0.05或P<0.01);IL-4水平略微升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG小鼠脾细胞中CD3^+细胞、CD4^+细胞和CD8^+细胞比例明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:MUC1-MBP融合蛋白联合R848或BCG均能诱导小鼠倾向于Th1的细胞免疫应答反应,R848是良好的MUC1-MBP候选佐剂分子。

重组鼠Muc1-MBP融合蛋白疫苗体内抗肿瘤作用

目的:研究重组鼠Muc1-MBP蛋白的体内抗肿瘤作用.方法:采用皮下注射法将不同剂量Muc1-MBP蛋白免疫小鼠,2wk/次,共免疫3次.在第3次免疫后4d,给予C57BL/6小鼠尾静脉注射LLC1细胞,或给予5GyX射线照射的ICR小鼠背部皮下注射MCF-7细胞.注射3wk后剥离并测量肿瘤大小;肿瘤组织行常规HE染色.免疫组织化学染色分析肿瘤周围浸润的淋巴细胞亚群.结果:LLC1细胞尾静脉接种后21d,肺肿瘤结节对照组,Muc1-MBP0.15g/L组小鼠分别为54和39个(100%),Muc1-MBP0.3g/L组小鼠共计17个(60%),提示Muc1-MBP0.3g/L组可显著抑制肺癌的生长(P<0.05),Muc1-MBP0.15g/L组作用较弱.皮下接种MCF-7细胞后21d,对照组,Muc1-MBP0.15g/L组小鼠100%(6/6)可见乳腺癌瘤体形成,平均体积分别为(142.8±70.2)和(96.1±53.4)mm3,Muc1-MBP0.3g/L组瘤体形成66.7%(4/6),平均体积为(54.5±46.7)mm3.表明Muc1-MBP0.3g/L组免疫后可显著抑制人乳腺癌移植瘤生长(P<0.05),Muc1-MBP0.15g/L组作用较弱.免疫组化结果显示Muc1-MBP免疫组肿瘤周围有大量CD4+和CD8+T的细胞浸润到肿瘤周围.结论:Muc1-MBP诱导免疫能够明显抑制LLC1,MCF-7细胞的生长,为临床应用研究奠定了基础.

人MUC1和鼠Muc1蛋白疫苗抗肿瘤作用的比较

目的:探讨重组人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP疫苗的抗肿瘤作用,为肿瘤疫苗的临床应用提供实验依据。方法:用人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP融合蛋白分别免疫小鼠,实验分为阴性对照组、人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组,ELISA方法分别检测小鼠血清抗人MUC1抗体与抗鼠Muc1抗体的交叉反应;LDH法检测小鼠抗人MUC1和鼠Muc1特异的CTL活性。通过小鼠肺癌转移模型及皮下人乳腺癌移植瘤模型检测人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP免疫诱导的抗肿瘤作用。结果:抗人MUC1抗体和鼠Muc1抗原可产生较强的交叉反应,抗鼠Muc1抗体与人MUC1抗原可产生较弱的交叉反应;人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP免疫均可诱导CTL杀伤活性,对MCF-7细胞杀伤活性分别为(48.7±7.1)%和(54.6±7.8)%,对LLC1细胞杀伤活性分别为(61.9±10.2)%和(43.5±8.4)%。人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组小鼠Lewis肺癌的肺结节转移抑制率分别为94.4%和68.5%;在人乳腺癌移植瘤实验中,人MUC1-MBP组、鼠Muc1-MBP组和PBS组小鼠肿瘤平均体积分别(23.5±15.7)、(56.5±46.7)和(142.8±70.2)mm3,人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论:人MUC1和鼠Muc1有共同的B和T细胞表位,人MUC1诱导的交叉反应更强烈;人MUC1-MBP诱导的抗肿瘤活性强于鼠Muc1-MBP抗肿瘤活性;人MUC1-MBP有希望发展成人类抗肿瘤疫苗。