人NMDA受体主亚基M3-M4环基因片段的高效表达、纯化与鉴定

用基因工程方法获得人N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate ,NMDA)受体主亚基M3 M4环靶片段 ,以此为免疫原 ,用于进一步免疫原性及相关应用研究 .自人脑胶质瘤组织中提取总RNA ,采用RT PCR扩增出人NMDA受体主亚基M3 M4环的基因片段 ,并按照计算机辅助原核表达载体pBV2 2 0中外源基因高效表达的数学模型预测方法 ,将其进行优化改构 .将目的基因克隆到pBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,升温诱导表达 ,从蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况 ,通过制备性SDS PAGE进行纯化 ,从相对分子质量、免疫反应性、肽质谱指纹分析等方面进行鉴定 .结果表明 ,成功构建了人NMDA受体主亚基M3 M4环的原核表达载体 (命名为pBV NR1L3) ,通过基因优化 ,实现了高效表达 .凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白 2 9% ,重组肽纯度达 95

计算机辅助设计提高人NMDA受体主亚基M3-M4环在E.coli中的表达

基于对螺旋区随机堆积的RNA二级结构的预测和密码子偏性计算 ,建立了pBV2 2 0载体中外源基因高效表达的判别模型。该模型认为 ,外源基因的表达水平与其 5′端 30～ 39区域 ,以及 3′端 30～ - 39区域的RNA二级结构自由能具有显著的统计学意义 ;其次与 3′端 9bp的局部密码子偏性相关。据此模型 ,使用RNAfold和Goldkey软件优化改构设计了用于克隆表达人NMDA受体主亚基M3 M4环的引物。将PCR扩增的基因克隆入pBV2 2 0载体中 ,在大肠杆菌DH5α宿主中获得了高效表达 (表达水平在 2 0 %以上 )。

离体培养人神经干细胞中NMDA受体亚单位NR2A和NR2B的表达

目的:研究早期离体培养的人胚胎海马神经干细胞(NSCs)中NMDA受体亚单位NR2A和NR2B的表达。方法:取胎龄8～12周人胚脑海马,进行NSCs分离、培养、传代和鉴定。通过免疫细胞化学和RT-PCR等方法检测传代1次和2次的人胚胎海马NSCs中NMDA受体亚单位NR2A和NR2B的蛋白和mRNA表达。结果:自孕8～12周人胚脑海马分离培养的NSCs,NMDA受体亚单位NR2A和NR2B免疫细胞化学反应呈阳性,这两种受体亚单位的mRNA均被检测到。结论:体外培养的早期人胚胎海马NSCs能稳定表达NMDA受体亚单位NR2A和NR2B。

NMDA受体亚单位NR1在离体人神经干细胞中的表达

目的研究离体培养的人海马神经干细胞（NSCs）中NMDA受体亚单位NR1的表达。方法分离培养胎龄8-12周人胚脑海马神经干细胞，对NSCs进行Nestin和分化鉴定。用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹和RT—PCR等方法检测原代、传代1次、传代2次的人胚胎海马NSCs中NR1蛋白和mRNA的表达。结果在孕8～12周人胚脑海马分离培养的NSCs中，NMDA受体亚单位NRI免疫细胞化学反应呈阳性，该受体亚单位的蛋白和mRNA均被检测钊。结论体外培养的早期人胚胎海马NSCs能稳定表达NMDA受体亚单位NR1。

巨细胞病毒对乳鼠海马神经元NMDA受体NR1亚基表达水平的影响

目的探讨巨细胞病毒对乳鼠海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR1亚基mRNA表达水平的影响。方法建立乳鼠海马神经元巨细胞病毒感染细胞模型,以感染后8、16、24h三个不同的时间点随机分为病毒组和对照组,观察海马神经元形态学改变,同时采用实时定量PCR技术检测病毒对海马神经元NMDA受体NR1亚基mRNA表达水平的影响。结果与对照组比较,病毒组逐渐出现细胞病变效应,最后细胞死亡;病毒组循环域值(Ct)8h为35.75±0.096、16h为34.636±1.565、24h为36.95±1.638。而对照组Ct值分别是30.60±0.37、28.937±0.064、36.95±1.638。两组差异有统计学意义(均P<0.05),病毒组内各时相目的基因两两比较F=130.629,P=0.00001。差异有统计学意义。提示病毒组NMDA受体NR1亚基mRNA表达水平均下降,并呈一定的时间-效应关系。结论巨细胞病毒对乳鼠海马神经元形态学发育和NMDA受体NR1亚基mRNA表达水平有严重影响,这可能是小鼠巨细胞病毒宫内感染导致学习记忆能力发育落后的分子机制之一。