人NMDA受体主亚基M3-M4环基因片段的高效表达、纯化与鉴定

用基因工程方法获得人N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate ,NMDA)受体主亚基M3 M4环靶片段 ,以此为免疫原 ,用于进一步免疫原性及相关应用研究 .自人脑胶质瘤组织中提取总RNA ,采用RT PCR扩增出人NMDA受体主亚基M3 M4环的基因片段 ,并按照计算机辅助原核表达载体pBV2 2 0中外源基因高效表达的数学模型预测方法 ,将其进行优化改构 .将目的基因克隆到pBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,升温诱导表达 ,从蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况 ,通过制备性SDS PAGE进行纯化 ,从相对分子质量、免疫反应性、肽质谱指纹分析等方面进行鉴定 .结果表明 ,成功构建了人NMDA受体主亚基M3 M4环的原核表达载体 (命名为pBV NR1L3) ,通过基因优化 ,实现了高效表达 .凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白 2 9% ,重组肽纯度达 95

重组人白细胞介素17的原核表达、纯化及鉴定

目的:优化重组人白细胞介素17的原核表达条件,选择不同的路线进行分离纯化.方法:利用SDS-PAGE方法分析比较重组人白细胞介素17在不同培养基、不同诱导时间的表达量,选择最适条件,大量扩增后,分离出包涵体,分别采用盐酸胍溶解法和SDS溶解法两条纯化路线进行进一步的分离和纯化,并对所纯化产物进行常规分析鉴定.结果:采用上述两种不同的溶解包涵体方法,通过后续复性及纯化,均可得到高纯度具有生物学活性的重组IL-17.采用SDS溶解法具有较高的得率,采用盐酸胍溶解法纯化得率较低,得产物的生物学活性较高.结论:通过表达及纯化,得到了大量高纯度具有活性的rhIL-17,为进一步研究IL-17的体内外生物学效应打下了基础.

人趋化因子受体CCR5胞外片段的融合表达与纯化

目的对人趋化因子受体CCR5的N端胞外部分与第二个胞外环(extracellular loop-2,ECL-2)进行融合表达与纯化。方法分别扩增人趋化因子受体CCR5的胞外N-端部分与ECL-2部分相应的编码序列,通过重叠延伸拼接(Splicing byoverlapping extension,SOE)PCR实现两片段DNA的拼接后(命名为CCR5-N-E2)克隆入质粒pBlueScript M13中,同时构建原核表达载体pET-21b(+)-CCR5-N-E2,转入表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白CCR5-N-E2,表达产物通过蛋白免疫印迹进行鉴定,并采用金属螯合层析法对重组表达产物进行纯化。结果经测序,构建的重组原核表达载体与预期完全一致,相对分子质量为8 500的目的蛋白在BL21(DE3)菌株中得到高效表达,表达量约占总蛋白的50%,表达产物以包涵体形式存在。蛋白免疫印迹实验表明该重组蛋白与抗CCR5 N-端序列的单克隆抗体发生特异性结合。通过Ni2+亲和层析,目的蛋白的纯度可达95%以上。结论实现CCR5-N-E2编码序列的拼接、融合蛋白的表达以及纯化,为广泛筛选以CCR5为靶点的临床治疗药物奠定了基础。

人催乳素受体胞外区蛋白的原核表达及纯化

目的:建立人催乳素受体的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:由RT-PCR获得人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)胞外区氨基酸的编码序列,扩增并通过酶切位点修饰后克隆至pMD18-T载体,经测序正确后,切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG诱导重组工程菌表达,使用谷胱甘肽偶联的GSTrapFF柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-hPRLR融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为37.6×103处有一条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-hPRLR融合蛋白,为进一步研究催乳素受体的功能和制备特异性的抗体奠定了基础。