抗三尖杉酯碱的HL60细胞蛋白质磷酸化

研究了抗三尖杉酯碱的ＨＬ６０细胞蛋白质磷酸化的变化。经差速离心得到纯膜蛋白，抗性细胞有一高度磷酸化的１１０ｋｕ的蛋白质存在，免疫沉淀ｃ－ＫＡＦ－１蛋白激酶，抗性细胞内ｃ－ＲＡＦ－１蛋白激酶磷酸化程度明显提高，其活性被蛋白激酶Ｃ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ明显地抑制。结果表明：ＨＬ６０细胞对三尖杉酯碱的抗药性与蛋白质高度磷酸化有关；抗性细胞内ｃ－ＲＡＦ－１蛋白激酶磷酸化程度明显提高，可能与多药抗药性和抗细胞调亡有关。

人RAF1-RAS结合域蛋白的纯化及功能验证

目的纯化人RAF1(RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)-RAS(rat sarcoma)结合域(RAF1-RAS binding domain,RAF1-RBD)蛋白并验证其功能。方法采用PCR法以人乳腺文库cDNA为模板扩增获得RAF1-RBD序列,将其插入至大肠杆菌表达载体pGEX-KG(带GST标签),获得pGEX-KG-RAF1-RBD重组质粒;转化该质粒至感受态细菌BL21(DE3),小量诱导并通过Western印迹法检测其表达;然后采用GST微珠纯化该蛋白;利用GST pull-down技术验证其与HRAS(Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白相互作用。结果双酶切鉴定及基因测序结果均表明成功构建重组质粒pGEX-KG-RAF1-RBD;Western印迹分析及SDS-PAGE方法检测结果说明重组蛋白相对分子质量(Mr)约42 000,与预期大小一致;GST pull-down技术证明RAF1-RBD与HRAS在体外能够结合。结论纯化的人RAF1-RBD蛋白与HRAS在体外存在相互作用。