人ZP3基因的RT-PCRcDNA克隆

目的:研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法:从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT-PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果:共克隆到ZP3-A(1300bp)、ZP3-B(1180bp)、ZP3-C(1200bp)和ZP3-D(1080bp)4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBISequenceViewer中公布的人ZP3mRNA序列(NM-007155)相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99.92%。结论:本研究克隆到的ZP3-AcDNA片段确是人ZP3基因无疑。

人ZP3 186S突变蛋白在毕赤酵母X33细胞中的表达

目的:利用毕赤酵母表达人ZP3186S蛋白(23～348氨基酸),为临床相关疾病的诊断提供实验材料。方法:经PCR获得编码人ZP3(23～348氨基酸)的基因,构建表达载体pPICZα-hZP3。将ZP3186位点精氨酸突变为丝氨酸构建pPICZα-hZP3186S质粒。转染毕赤酵母X33细胞,用高浓度Zeocin筛选转染细胞,甲醇诱导目的蛋白分泌,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定人ZP3186S蛋白。结果:pPICZα-hZP3186S表达质粒经测序正确,并在毕赤酵母X33中能够高效表达。结论:毕赤酵母能够分泌性表达重组人ZP3186S蛋白(23～348氨基酸),进一步研究其生物学活性为研制不孕症诊断试剂和免疫避孕疫苗提供实验材料。