APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。

Kozak序列(+4G)对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白751在CHO细胞中表达的影响

目的:观察Kozak序列(+4G)对稳定转染的人淀粉样前体蛋白(hAPP751)-EGFP融合真核表达载体在CHO细胞中表达的影响,为APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法:分别将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段亚克隆入pEGFP-N1表达载体,得到pEGFP-hAPP751(+4G)和pEGFP-hAPP751重组质粒,转染CHO细胞,通过G418筛选稳定转染细胞株,再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆,并观察融合蛋白的表达强度和细胞定位,最后用EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证明将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入了真核表达载体pEGFP-N1中;荧光显微镜下观察pEGFP-hAPP751(+4G)稳定转染细胞的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光,其中在细胞质中成不均匀颗粒状分布,Western印迹检测到相对分子质量约156 000的融合表达蛋白,与预期相符;pEGFP-hAPP751转染细胞,其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布,Western印迹检测到相对分子质量约26 000的EGFP,但检测不到预期的hAPP751-EGFP融合表达蛋白。结论:Kozak序列(+4G)可以明显促进hAPP751的表达,获得稳定转染且高水平融合表达hAPP751-EGFP的细胞株。

加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究

目的观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制。方法采用5μMAβ_(1-40)作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ_(1-40)处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究。倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平。结果 Aβ_(1-40)孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P<0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ_(1-40)孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P<0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高。结论加兰他敏通过抑制Aβ_(1-40)诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用。

慢性牙周炎中淀粉样前体蛋白家族的表达研究

目的·观察淀粉样前体蛋白(APP)家族在慢性牙周炎牙龈组织中的表达情况,及其在炎症微环境下人牙龈成纤维细胞(HGF)中的表达。方法·采用real-time PCR技术和免疫组化法分别检测健康成人和慢性牙周炎病例牙龈组织中APP家族基因和蛋白表达变化。体外培养HGF细胞,用1μg/m L牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.g-LPS)模拟炎症微环境,运用real-time PCR技术检测APP家族基因表达。结果·慢性牙周炎组与健康组相比,APP和APLP2基因和蛋白表达均显著升高,APLP1无明显变化。HGF细胞在P.g-LPS刺激后APP、APLP1和APLP2基因表达均升高。结论·APP家族可能在慢性牙周炎发生发展过程中发挥一定作用。

APP基因转染SK-N-SH细胞中阿尔兹海默病相关基因表达水平的变化

目的探讨淀粉样前体蛋白(APP)表达对AD相关基因表达水平的影响。方法构建APP基因的真核表达质粒,并转染人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞,实时定量PCR法检测转染细胞中SIRT1、Tau、PS1、PS2及Apo E4的表达水平变化。结果成功构建了APP基因的真核表达载体,相对于空载体转染组,转染24、48 h时APP基因的过表达对SK-N-SH中SIRT1基因的表达具有明显的抑制作用(P<0.01、P<0.05);对Apo E4的表达水平有一定的上调作用(P<0.001)。转染24、48 h时,PS2基因的表达水平均有一定的上调,但均未发现差异有统计学意义(P>0.05)。转染24 h时,对PS1有上调趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),转染48h时,则有下调作用(P<0.05)。对Tau,转染24 h时有明显的上调作用(P<0.001),但转染48 h时,则有下调趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。相对于空载体转染组,APP基因转染组的细胞活力显著降低。结论 APP基因的过表达对SK-N-SH细胞中SIRT1基因的表达具有明显的抑制作用;对Apo E4、PS2的表达水平有一定的上调作用,对Tau、PS1的表达水平有上调和下调作用不一,表明这些基因之间存在密切关系和对AD病理机制影响的复杂性,这为揭示不同AD相关基因之间的相互影响及调控机制提供一定的实验证据。

脑梗死后海马神经元β-APP及其产物与ApoE的表达

目的:应用常规HE染色和免疫组织化学染色方法,观察人脑梗死后海马CA1区和CA3区神经元中β-APP、Aβ1-40、Aβ1-42及ApoE的表达,探讨它们表达变化的时间规律,以期对临床治疗提供可靠的实验资料。方法:分脑缺血组和对照组,脑缺血组按缺血时间分为缺血2h-6h组、7h-24h组、25h-48 h组、49h-72h组、73h-96h组、97h-144 h组和145h-168 h组。采用HE染色方法观察神经细胞损伤情况;免疫组织化学染色检测β-APP、Aβ1-40、Aβ1-42与ApoE在尸检脑标本海马CA1区、CA3区神经元的表达,在显微镜下对免疫组织化学染色阳性细胞计数,实验结果应用SPSS12.0统计软件进行分析。结果:与对照组相比,Aβ1-40的表达在缺血2h后明显增加,73h-96 h达高峰,以后有所回落,但仍高于对照组;β-APP在缺血2 h-6 h表达呈峰值,49 h-96h呈现第二次高峰,96 h以后下降,但仍高于对照组;于缺血24 h后,β-APP和Aβ1-40的增加呈显著的正相关。缺血2 h后,Aβ1-42表达开始增加,25 h-48 h达高峰;缺血6 h后,ApoE表达开始增加,但97 h-144 h为高峰期。结论:人脑梗死后β-APP、Aβ-40和Aβ1-42表达增加,它们可协同加重脑缺血性损伤;而ApoE脑保护作用可能增强。

正常人血清β-淀粉样肽及血小板β淀粉样前蛋白水平与年龄的相关性探讨

目的:探讨正常人血清β-淀粉样肽及血小板β淀粉样前蛋白水平与年龄的相关性.方法:应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定正常中青年人血清APP和Aβ40、Aβ42含量.结果:血清Aβ40和Aβ42水平在39岁以下组最低,40~49岁年龄组最高,而到了50岁以上,反而比40~49岁组降低;APP在40~49岁年龄组最低,比39岁以下组低,50岁以上组最高.结论:在40~49岁年龄组,血清APP分解为Aβ40和Aβ42增加.

野生型和突变型APP695稳定转染CHO分泌Aβ40和Aβ42的比较

目的:建立野生型和瑞典突变型淀粉样蛋白前体695(APP695)稳定转染CHO细胞株,比较两者分泌Aβ40和Aβ42的能力,为筛选β分泌酶抑制剂奠定基础。方法:以人淀粉样蛋白前体751(APP751)基因序列为模板,通过突变分别获得野生型APP695wt和瑞典突变型APP695sw序列,再连入真核表达载体pcDNA3.1,转染CHO细胞并经G418筛选出稳转细胞株,通过ELISA法检测培养上清中Aβ40和Aβ42的含量,然后检测APPβ位点抗体对Aβ分泌的影响。结果:获得了APP695wt和APP695sw序列,构建载体并稳定转染的CHO细胞株,可检测到两种目的蛋白均有表达,相对分子质量约为98kDa。ELISA法只能检测到APP695sw稳转细胞有高水平Aβ40和Aβ42产生,Aβ40的分泌量约是Aβ42的24.57倍,可达约14000pg/ml。APPβ位点抗体可降低Aβ分泌量,但不影响Aβ40/Aβ42的比值。结论:成功获得APP695wt和APP695sw稳定转染细胞株,其中后者高分泌Aβ40和A42,适用于β分泌酶抑制剂的筛选。

亚硫酸钠对人胚肾293细胞APP蛋白表达影响

目的研究食品添加剂亚硫酸钠（Na2SO3）对β-淀粉样物质（Aβ）前体蛋白（APP）表达的影响。方法用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测人胚肾293（HEK293）中APP基因的mRNA表达水平,用蛋白印迹法（W est-ern-b lotting）检测HEK293中APP蛋白水平。结果RT-PCR检测显示,HEK293接触0.039-10 mmol/L Na2SO324 h后细胞内APP基因的3个亚型APP695、APP751、APP770的mRNA水平均未见明显改变。蛋白印迹分析发现,10mmol/L Na2SO3可明显降低细胞内APP蛋白水平,为阴性对照组的0.908倍 而较低剂量组0.039-2.5 mmol/LNa2SO3却可以明显增加细胞内APP蛋白的水平,分别达到阴性对照组的1.596,1.630,1.556和1.446倍。结论亚硫酸钠在一定剂量范围内影响HEK293细胞内APP蛋白水平,可能对老年性痴呆的发生有一定影响,但是细胞内APP蛋白水平的增加不是由该基因转录水平增加所致。

人β-分泌酶与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)是最常见的引起痴呆的神经退行性疾病,主要表现为进行性的认知功能障碍和行为能力障碍,其病理特征是神经细胞外不溶性淀粉样蛋白Aβ以及胞内由过磷酸化tau形成的纤维缠结.这种胞外聚合物主要由Aβ4两组成,它是由淀粉样前体蛋白APP依次经β分泌酶(β-secretase)和γ分泌酶(γ-secretase)剪切所产生的。沉积和细胞内过量的Tau蛋白磷酸化形成神经纤维缠结(NFTs),从而引起氧化应激和慢性炎症损伤,导致神经元丢失和突触功能障碍。基于对AD病理特征认识,以往将针对Aβ和NFTs的治疗作为AD治疗的主要方向,但是经过数十年的研究并未取得长足的进展。近年来,随着人们对B淀粉蛋白前体蛋白(APP)处理途径的认识不断深入,人们越来越重视APP降解产生Aβ的关键酶在AD发病中的作用。因此,本文就人β-分泌酶(β-secreatase,BACE1)的相关特性及在AD发病中的相关作用,以及在AD治疗中的研究进展做一综述。