载脂蛋白A-Ⅰ对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞生物行为及VEGF表达的抑制作用

背景视网膜血管内皮细胞（RVECs）是视网膜微血管的主要成分，通过增生、迁移以及血管发生等生物行为在糖尿病视网膜病变（DR）的发生和发展中发挥关键作用。载脂蛋白A-Ⅰ（ApoA-Ⅰ）是高密度脂蛋白中主要的载脂蛋白，既往研究表明ApoA-Ⅰ在糖尿病患者视网膜组织内呈高表达，且在不同微环境中对RVECs发挥不同作用，但其在高糖环境下与RVECs生物学行为的关系仍不清楚。目的研究ApoA-Ⅰ对高糖环境下培养的人RVECs（hRVECs）生物行为及血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法用含体积分数10%胎牛血清的DMEM体外培养hRVECs并传代，取3～6代细胞用于实验。将培养的细胞分为低糖组、低糖＋ApoA-Ⅰ组、高糖组和高糖＋ApoA-Ⅰ组，按照分组分别在DMEM中添加葡萄糖和ApoA-Ⅰ，低糖浓度为5 mmol/L，高糖浓度为25 mmol/L，ApoA-Ⅰ终质量浓度为30 μg/ml。采用细胞计数试剂盒-8、CCK-8法检测细胞增生能力（吸光度，A值）；采用细胞划痕法检测细胞的迁移率；采用管腔形成实验检测培养细胞的体外成管能力；分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测各组细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量。结果高糖组细胞增生值（A值）和细胞迁移率明显高于低糖组，高糖＋ApoA-Ⅰ组细胞增生值和细胞迁移率明显低于高糖组，差异均有统计学意义（A值：P＝0.001、0.033；迁移率：P＝0.001、0.010）。低糖组、低糖＋ApoA-Ⅰ组、高糖组和高糖＋ApoA-Ⅰ组管腔数分别为（7.250±2.217）、（9.250±2.630）、（19.000±3.916）和（11.500±3.697）个，组间总体比较差异有统计学意义（F＝10.335，P＝0.001）。高糖组管腔数较低糖组显著增加，高糖＋ApoA-Ⅰ组较高糖组管腔数显著减少，差异均有统计学意义（P＝0.001、0.037）。低糖组、低糖＋ApoA-Ⅰ组、高糖组和高糖＋ApoA-Ⅰ组细胞中VEGF mRNA相对表达量分别为0.944±0.083、1.117±0.204、1.768±0.164和1.301±0.077，VEGF蛋白相对表达量分别为1.000±0.130、1.217±0.152、1.871±0.101和1.609±0.087，组间总体比较差异均有统计学意义（mRNA：F＝18.640，P＝0.001；蛋白：F＝10.335，P＝0.001），其中高糖组细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量均明显高于低糖组和高糖＋ApoA-Ⅰ组，差异均有统计学意义（mRNA：P＝0.000、0.004；蛋白：P＝0.000、0.029）。结论ApoA-Ⅰ对高糖环境下hRVECs的增生、迁移及管腔形成具有抑制作用，可能与其下调细胞VEGF的表达有关。

人载脂蛋白A-I的原核表达及二级结构和功能鉴定

目的为获得高产量并具有正常结构和生物学活性的原核表达人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)。方法利用DNA重组技术对人apoA-Ⅰ的前8个氨基酸引入沉默突变,以pET-30b(+)为原核表达载体,在apoA-Ⅰ多肽链C-末端引入6×组氨酸标签,采用镍亲和层析对表达蛋白进行纯化。分别使用圆二色分析、浊度澄清试验和胆固醇外流试验对重组apoA-Ⅰ的α螺旋含量、脂质结合动力学及促细胞胆固醇外流能力进行评价。结果获得高表达产量的重组apoA-Ⅰ(12 mg纯化apoA-Ⅰ蛋白/L菌液);重组蛋白的α螺旋含量为(54±4)%,脂质结合动力学速率常数k1/2为0.059±0.002 min-1,胆固醇外流百分比为(16.68±1.77)%。结论可获得高产量并具有生物学活性的重组人apoA-Ⅰ;为构建apoA-Ⅰ其他突变体提供模式。

血清前清蛋白、C反应蛋白及载脂蛋白A1对重症肺炎患者预后评估的价值

目的探讨血清前清蛋白(PAB)、C反应蛋白(CRP)及载脂蛋白A1(Apo A1)在评估重症肺炎患者预后中的价值。方法选取63例重症肺炎患者,检测入院后24h内空腹血清PAB、CRP及Apo A1,并计算急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ);按患者APACHEⅡ评分值将患者分为两组(<20分为A组,≥20分为B组),分析两组患者多器官功能障碍综合征(MODS)发生率和病死率。将患者分为MODS组及非MODS组,并根据转归将患者分为存活组和死亡组,比较各组患者的血清PAB、CRP及Apo A1水平的差异。结果 B组MODS发生率和病死率(57.9%,47.4%)均显著高于A组(24.0%,16.0%),差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。MODS组[(134.13±36.20)mg/L,(0.62±0.21)g/L]及死亡组[(129.05±52.24)mg/L,(0.76±0.29)g/L]PAB、Apo A1分别低于非MODS组[(215.03±72.08)mg/L,(1.06±0.39)g/L]及存活组[(185.52±57.63)mg/L,(1.15±0.36)g/L],差异有统计学意义(P<0.05),而MODS组(102.37±35.65)mg/L及死亡组(96.37±34.72)mg/L CRP分别高于非MODS组(69.68±32.92)mg/L及存活组(62.94±38.36)mg/L(P<0.05)。结论血清PAB、CRP和Apo A1这3种急性时相蛋白对于评估重症肺炎患者病情的危重程度及预后具有一定的价值。