小窝蛋白-1对N-甲基-D天冬氨酸诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1的破坏作用研究

目的:探索小窝蛋白(Cav)-1对N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO-1)和血脑屏障完整性的破坏作用。方法:体外培养人脑微血管内皮细胞HBEC-5i并构建血脑屏障模型。以不同浓度的NMDA孵育HBEC-5i,并观察其对细胞活力的影响。细胞分别用NMDA受体(NMDAR)拮抗剂MK-801或Cav-1抑制剂Daidzein预处理后再用NMDA孵育。蛋白免疫印记(western blotting)法检测ZO-1、Cav-1及p-Cav-1蛋白的表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测ZO-1 mRNA的表达;跨膜细胞电阻仪Millicell ERS Volt-Ohm meter测量血脑屏障模型跨内皮细胞膜电阻(TEER)值。结果:与对照组比较,NMDA组p-Cav-1蛋白表达升高(P<0.05),ZO-1蛋白和mRNA表达下降(P<0.01),同时TEER值下降(P<0.001)。与NMDA组比较,使用MK801拮抗NMDAR活化后ZO-1蛋白和mRNA水平上调(P<0.05),TEER值增加(P<0.001);用Daidzein抑制Cav-1活化可下调p-Cav-1蛋白表达(P<0.05),上调ZO-1蛋白和mRNA表达(P<0.05)以及增加TEER(P<0.001)。结论:NMDA可诱导HBEC-5i中紧密连接蛋白ZO-1的破坏,从而增加紧密连接屏障的通透性。抑制Cav-1的活化可阻断NMDA诱导的ZO-1表达下降和减少TEER。

丹酚酸F调控Bax/Caspase-3/GSDME信号通路改善肾小管上皮细胞焦亡作用机制

目的:基于B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)/胱天蛋白酶-3(Caspase-3)/消皮素E(GSDME)通路探讨丹酚酸F改善高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的机制。方法:细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测不同浓度(2.5、5、10、20μmol·L^(-1))丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞相对活力的影响及给予丹酚酸F不同干预时间条件下HK-2细胞的相对活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒分别检测细胞培养基上清中LDH和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;流式细胞术结合异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)和Hoechst 33342/PI染色检测丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞PI阳性率的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)评价丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中Bax、Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、Caspase-3、GSDME蛋白表达及激活情况的影响。2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法(DCFH-DA)及线粒体膜电位(JC-1)考察丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中活性氧(ROS)产生及线粒体膜电位的影响。结果:与空白组比较,模型组细胞活力显著降低(P<0.01),乳酸脱氢酶、炎症因子IL-1β、PI阳性细胞比例均显著升高(P<0.01);Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),HK-2细胞线粒体膜电位的降低,ROS产生过量蓄积。与模型组比较,丹酚酸F组有效改善高糖诱导所致HK-2细胞的损伤(P<0.05),明显降低细胞培养基上清中LDH及IL-1β含量(P<0.05,P<0.01),显著减少PI阳性细胞的比例(P<0.01);丹酚酸F组降低Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达,明显升高Bcl-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01),HK-2细胞线粒体膜电位的升高,ROS的过量蓄积减少。结论:丹酚酸F通过减少ROS的产生,改善线粒体膜电位失衡,抑制Bax/Caspase-3/GSDME信号通路介导的细胞焦亡发挥改善高糖诱导所致HK-2细胞损伤的作用。

孕早期人巨细胞病毒感染对仔鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基表达的影响

目的探讨孕早期人巨细胞病毒(HCMV)感染对子代SD大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基的影响及对仔鼠学习记忆的影响。方法取8周龄SPF级SD雌鼠18只。按雌雄31合笼交配,将受精大鼠随机分为实验组和对照组,每组9只,于妊娠第5天分别腹腔内注射5×107L-1半数组织培养感染量(TCID50)HCMV悬液0.8 mL和等量的人胚成纤维细胞上清液。出生后1个月分别从每组随机抽取10只子代大鼠,取仔鼠脑组织,采用HE染色观察仔鼠海马形态学变化;使用Morris水迷宫评价子代大鼠的学习记忆功能;应用免疫组织化学方法检测大鼠海马组织NMDA受体表达变化。采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。结果对照组子代大鼠海马未见神经元缺失,排列紧密,均匀整齐,胞核呈圆形或椭圆形,核仁明显,染色质均匀;与对照组比较,实验组子代大鼠海马有神经细胞坏死、减少、水肿、细胞核消失现象,部分细胞呈巨细胞变;在Morris水迷宫实验中,实验组子代大鼠的学习记忆成绩较对照组明显下降(Pa<0.01);免疫组织化学结果显示实验组子代大鼠海马组织NR1、NR2A及NR2B平均吸光度均较对照组低(Pa<0.01)。结论孕早期HCMV感染可导致仔鼠学习记忆能力受损,可能与其海马区NMDA受体的表达减少有关。