抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特异性抗原

重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。

人牙髓细胞骨涎蛋白成熟肽基因克隆和序列分析

目的 :证实人牙髓细胞中骨涎蛋白 (Bonesialoprotein ,BSP)的表达 ,获得BSP成熟肽基因。方法 :体外培养人牙髓细胞 ,提取人牙髓细胞总RNA ,反转录合成cDNA ,以特异性引物扩增BSP成熟肽基因并克隆到pBluescriptKS载体 ,筛选阳性克隆进行序列测定。结果 :PCR扩增到一特异性的约 90 0bp的片段 ,克隆后筛选出阳性克隆进行序列分析 ,测定结果表明与国外已发表的序列完全一致。结论 :人牙髓细胞中有BSP基因的表达 ,并克隆得到BSP成熟肽基因 ,为表达有活性的BSP蛋白 ,进一步研究其生物学功能奠定基础。

间充质干细胞的成骨细胞分化和免疫组织化学鉴定

目的探讨脐带的间充质干细胞分化为成骨细胞的影响因素和免疫组织化学鉴定。方法收集306例冻存的健康胎儿脐带,采用华尔通胶组织块贴壁法从脐带组织中分离间充质干细胞,利用荧光显微镜观察原代细胞的细胞形态。脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期采用免疫组织化学检测。复苏冻存的脐带间充质干细胞,并传代培养至10代。对第10代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导,其成骨能力分别通过钙结节和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定。结果免疫组织化学结果显示,培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志物CD73、CD90和CD105,但是不表达造血细胞的表面标志物CD34和CD45。复苏后细胞的存活率是90%。细胞周期显示,第10代的细胞有80%处于G0/G1期,20%处于S+G2/M期。成骨细胞刺激因子诱导干细胞的骨涎蛋白染色呈阳性,并形成矿化的钙结节。结论冻存的脐带间充质干细胞在成骨细胞刺激因子下能被诱导分化为成骨细胞,具有高度自我增殖和多向分化能力。

发酵条件对毕赤酵母工程菌产rhBSP的影响

Pichia pastrois酵母工程菌 GS115 / p PICZa A- hbsp能分泌表达重组人骨唾液酸蛋白 (rh BSP)。本文通过其发酵条件的研究 ,找出摇瓶发酵表达 rh BSP的最适条件。以 BMGY作为种子培养基 ,菌体密度 A6 0 0 达到 9时 ,重悬于1/ 5体积的 BMMY培养基中 ,A6 0 0 达到 4 5 ,p H值 6 .0 ,2 %甲醇诱导 4 d,rh BSP产量达高峰期 ,最大表达量为 0 .2 5 5g/ L。

骨涎蛋白在人牙胚和下颌骨发育中表达的研究

目的 :观察骨涎蛋白 (BSP)在人牙胚发育和分化过程中的分布情况。方法 :采用免疫组化和原位杂交的方法进行人牙胚和下颌骨中BSP的定位研究。结果 :钟状期牙胚中成牙本质细胞BSP为强阳性 ,成釉细胞、前期牙本质和釉质为阳性 ;骨组织和成骨细胞呈强阳性 ;外釉上皮、星网状层、中间层、内釉上皮和牙乳头为阴性。免疫组化与原位杂交的结果基本一致。结论 :BSP与矿化组织如牙本质、釉质、骨组织的形成和矿化有关。

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。

抗人骨唾液蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人骨唾液蛋白（BSP）单克隆抗体（mAb），并对其生物学特性进行鉴定，为BSP作为乳腺癌骨转移临床诊断靶点的研究奠定基础。方法重组BSP蛋白免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2／0细胞融合，经筛选建立可稳定分泌抗BSPmAb细胞株，制备腹腔积液，ProteinG纯化。ELISA检测抗体的效价和亲和力，并用亚型鉴定试纸条鉴定mAb的亚型。应用Western blotting检测mAb的特异性，进一步利用纯化的mAb经免疫组织化学法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中BSP的表达情况。结果获得9株抗BSPmAb细胞株，选择其中2株（D001和D002）进一步鉴定，其上清效价分别为1：5120和1：10240，腹腔积液效价分别为1：25600和1：51200。2株抗体亚型均为IgG1型，轻链均为K型。Western blotting结果均在预期位置出现阳性条带。利用此2株细胞株所得抗体均可在乳腺癌细胞MDA-MB-231中检测到BSP的表达。结论成功制备能特异性识别BSP的mAb，为进一步研究BSP的生物学功能以及对BSP作为乳腺癌骨转移的标志物进行临床评价奠定基础。

高浓度脂多糖对骨唾液酸蛋白和IL-8基因表达的影响

目的研究高浓度牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g.)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)中骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP)和白细胞介素8(Interleukin 8,IL-8)基因表达的调节。方法 10mg/L P.g.LPS处理第4-5代体外培养的hPDLFs不同时间(1、4、8、12、24小时)后,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测骨唾液酸蛋白(BSP)和IL-8基因的表达水平。结果 10mg/L P.g.LPS作用hPDLFs 1、4小时后BSP mRNA的表达水平稍有下降(P>0.05),并在刺激8、12、24小时后BSP mRNA的表达水平显著下降(P<0.01);此外10mg/L P.g.LPS明显上调hPDLFs中IL-8 mRNA表达水平,在处理8h时刺激作用最为明显,达到高峰(P<0.01)。结论高浓度(10mg/L)P.g.LPS对hPDLFs的BSP基因表达有抑制作用,而对IL-8基因表达有增强作用。