Chemical synthesis and cloning of human calcitonin (hCT) cDNA

Chemical synthesis and cloning of human calcitonin (hCT) cDNA. Methods and Results:The cDNA sequence coding for human calcitonin (hCT) was divided into 6 fragments, synthesized by ABI 391 DNA synthesis instrument and cloned into PGEM7Z(+) vector following phosphorylation, annealing and ligation of the 6 fragments. The sequence of cloned hCT cDNA was proved to be the same as designed by double DNA sequencing. Conclusion: A reliable and forthright method of chemical synthesis and cloning of oligo-peplides cDNA (or gene) was provided in this study. This paper is a basic work for expression of hCT cDNA.

新型降钙素的基因合成与克隆表达

借助计算机辅助设计了一种新的人降钙素类似物 (新型降钙素 )。根据密码子偏爱性原理及基因工程操作原则设计了它的基因 ,运用化学法和酶法相结合的技术合成了该基因 ,并克隆到质粒 pUC19中 ,DNA测序验证正确。该基因被克隆到融合型表达载体pGEX 2T中 ,重组融合型表达载体nCT/ pGEX 2T转化E coliBL2 1,培养表达 ,SDS PAGE分析可见Mr 约 310 0 0的融合蛋白带 ,融合蛋白占细胞内总蛋白的 34%。WesternBlotting分析证明该新型降钙素获得表达。

新型降钙素基因工程菌高表达发酵条件的研究

对新型降钙素基因工程菌 n CT/p GEX-2 T/E.coli BL2 1高表达发酵条件进行了优化研究。研究表明重组工程菌遗传性状稳定 ,采用 LB培养基、1 %接种量 ,当菌体浓度到达 A6 0 0 nm 0 .6时 ,添加诱导剂 IPTG至终浓度为 0 .l mmol/L,37℃培养 4 h,可使含新型降钙素的融合蛋白高效表达 ,融合蛋白占菌体总蛋白的 35%。2 0 L发酵罐中采用上述条件发酵培养 ,融合蛋白亦可高效表达 ( 32 % ) ,其菌体密度是摇瓶培养发酵的两倍。Western-blotting试验表明融合蛋白中含有新型降钙素 。

可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒对糖尿病大鼠阴茎勃起的作用

目的:探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因转移在糖尿病大鼠阴茎海绵体平滑肌分泌表达及其对阴茎勃起的作用。方法:建立链佐脲菌素(STZ)糖尿病大鼠模型,随机分为3组,分别将VssHGCMV-hCGRP、VssCMV-GFP和rAAV空病毒液注射于阴茎海绵体。在注射后5 d,采用SMUP-PC型生物信号处理系统检测阴茎背神经电刺激诱发的阴茎勃起反应及海绵体内压(ICP)变化。切取海绵体组织,通过免疫组化技术和激光共聚焦显微镜分别检测hCGRP和绿色荧光蛋白(GFP)表达,以放射免疫法检测组织中环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)变化。结果:在VssCMV-GFP转染后5 d,显示阴茎海绵体内几乎所有组织均有广泛的GFP表达,而rAAV空病毒转染的海绵体则无GFP表达。VssHGCMV-hCGRP转染STZ诱导的糖尿病大鼠后5d,电刺激阴茎背神经可诱发明显的阴茎勃起,监测ICP明显增高[(60.5±4.5)mm Hg,1 mm Hg=0.133kPa],而对rAAV空病毒转染的对照组STZ糖尿病大鼠以同样的参数电刺激阴茎背神经则无勃起反应,ICP无明显增加[(22.3±1.3)mm Hg],两组差异有显著性(P<0.01)。免疫组化观察显示在VssHGCMV-hCGRP转染的STZ糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中hCGRP表达增强,同时当电刺激阴茎背神经诱发勃起反应时,海绵体内cAMP和cGMP水平均升高,分别为(48.4±6.5)nmol/L和(21.2±13.6)nmol/L,较rAAV空病毒组[(16.7±2.5)nmol/L和(0.42±0.12)nmol/L]明显增高(P<0.01)。结论:经阴茎海绵体内注射重组腺相关病毒VssHGCMV-hCGRP在糖尿病大鼠阴茎海绵体内获得了hCGRP转基因高效表达,其可增加阴茎背神经电刺激诱发的阴茎ICP和勃起反应。

人降钙素cDNA的化学合成与克隆

目的：克隆人降钙素ｃＤＮＡ。方法和结果：应用ＡＢＩ３９１ＤＮＡ合成仪，将人降钙素ｃＤＮＡ分成６个片段合成。退火、磷酸化、连接，最终将人降钙素ｃＤＮＡ克隆于载体ｐＧＥＭ７ｚ（＋），经ＤＮＡ双链测序，证明克隆到的人降钙素ｃＤＮＡ序列与设计的完全一致。结论：本研究为寡肽ｃＤＮＡ（或基因）的化学合成与克隆提供了简捷、可靠的方法；为人的降钙素ｃＤＮＡ的高效表达奠定了基础。

一种新型人源化鲑鱼降钙素突变体的构建与表达

目的 降低鲑鱼降钙素（sCT）对人体的免疫原性。方法 设计并合成人源化鲑鱼降钙素（11 ～ 17）hsCT基因，用基因重组方法构建表达载体，转入大肠杆菌G1724中，经色氨酸诱导表达；用渗透压法处理菌体纯化融合蛋白；以大鼠血清钙浓度降低方法测定hsCT生物活性；用定量Western blot法测定hsCT免疫原性。结果 重组pTrxFus-hsCT质粒在大肠杆菌中获得高效可溶性融合蛋白表达, 表达水平达46%以上, 并得到纯度约90%的融合蛋白,rhsCT保存了鲑鱼降钙素前体活性的一半以上, 免疫原性降低了55%。结论 获得一种新型人源化降钙素（11 ～ 17）hsCT，其保存较高sCT前体的活性，免疫原性明显降低。

基因工程制备重组人降钙素类似物

构建融合表达人降钙素类似物的工程菌 ,然后纯化 GST- h CTa- Leu融合蛋白 ,凝血酶酶切后 ,再经离子交换层析、脱盐 ,获得纯度大于 90 %的 h CTa前体 .对 h CTa前体的 C末端进行修饰 ,得线形 h CTa- NH2 ,再通过复性 ,获得了具有与天然人降钙素活性相当的 h CTa.

人α降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分离纯化

化学合成的人α降钙素基因相关肽(CGRP)基因用PCR法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体pVT102U/α中的α交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌S-78进行表达,培养物的上清用酶标(ELISA)鉴定为阳性,而对照S-78、pVT102U/α为阴性,表达量用ELISA定量大于2mm/L。表达产物经阳离子交换层析(CM-Sephadex C_(25))和HPLC纯化得到了HPLC纯产品。纯化后的CGRP能引起小鼠血压的降低,说明表达的目的蛋白既有CGRP的免疫结合活性,又有CGRP的生理活性。测定其N-端10个氨基酸序列,证明人工合成的CGRP基因在酵母细胞中已正确表达。

新型降钙素的分子设计

以人和鲑鱼降钙素为先导物 ,根据多肽类药物设计原理 ,借助多肽蛋白质计算机分析软件辅助设计了一种新的人降钙素类似物 ,简称新型降钙素 .计算机分析结果表明 :该新型降钙素等电点提高 (pI 8.7) ,C 末端亲水性增加 ,抗原表位分析图谱与人降钙素的相同 .利用基因工程法制备新型降钙素 。

重组人甲状旁腺素（1-34）治疗原发性骨质疏松症疗效观察

目的 观察对比重组人甲状旁腺素（1-34）[PTH（1-34）]和降钙素对原发性骨质疏松症的疗效.方法 将20例原发性骨质疏松症患者随机分为试验组和对照组.试验组皮下注射PTH（1-34）20μg,每天1次;对照组肌肉注射降钙素20 IU,每周1次,两组均每日口服钙尔奇D 600mg,连续治疗6个月.所有患者于治疗前后枪测腰椎（L2～L4）、股骨颈骨密度、血钙及血清骨特异性碱性磷酸酶（BSAP）、血清I型胶原交基C端肽（CTX）、PTH等指标及观察有无不良反应.结果 治疗后PTH组和降钙素组腰椎（L2～L4）骨密度变化较治疗前均有明显增加,且有统计学意义.治疗后两组股骨颈骨密度变化较治疗前无明显改善（P〉0.05）,两组间比较无明显差异（P〉0.05）.PTH组BSAP变化值明显高于对照组,两组间比较差异有统计学意义（P〈0.01）;两组治疗后血、尿常规、肝、肾功能均未见明显异常.结论 PTH（1-34）与降钙素都能显著提高腰椎（L2～L4）骨密度,对于原发性骨质疏松症治疗安全有效.

重组人甲状旁腺激素(1-34)和依降钙素治疗原发性骨质疏松症的随机对照研究

目的评价重组人甲状旁腺激素(1-34)[rhPTH(1-34)]治疗原发性骨质疏松症(OP)的疗效和安全性,并与依降钙素进行对比。方法 60例原发性OP患者按3:1被随机分入rhPTH(1-34)组(PTH组)和依降钙素组(CT组)。PTH组予rhPTH(1-34)20μg每日1次皮下注射,连续用药18月。CT组予益钙宁20U每周1次肌肉注射,连续用药12月。受试前检测腰2-4椎体(L2-4)和股骨颈骨密度(BMD)、血钙、血磷、尿钙、血清骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、尿Ⅰ型胶原交基C端肽(CTX-I),治疗后6、12、18月复查上述指标。结果与基线时比较,PTH组L2-4BMD在治疗6、12、18月时显著升高,股骨颈BMD在18月时显著升高,BSAP在6、12月时均显著升高,CTX-I校正值在6、12、18月时均显著升高;CT组L2-4BMD在治疗12月前升高,股骨颈BMD在12、18月时升高,BSAP12、18月时均显著下降,CTX-I校正值治疗前后无统计学差异。两组比较,PTH组患者在6、12月和18月时L2-4的BMD增长值和增长率均高于CT组。但CT组在治疗12月时股骨颈BMD增长值高于PTH组,不良反应:两组差异无统计学意义;PTH组有一过性高钙血症。结论 rhPTH(1-34)治疗原发性OP安全有效,对改善椎体BMD起效时间、增长速度和增长幅度均优于依降钙素,但改善股骨颈BMD较依降钙素起效更慢,增长幅度更小。

CGRP通过激活cAMP/PPARγ/eNOS途径改善血管内皮细胞胰岛素抵抗

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗的保护作用及其机制。方法:用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立胰岛素抵抗细胞模型(irHUVEC),分别用葡萄糖氧化酶法和蒽酮-硫酸法检测细胞葡萄糖消耗能力和糖原合成能力;RT-PCR和Westernblot分别检测目的蛋白和基因表达。结果:33.3mmol/L的高糖和5μmol/L的胰岛素处理24h可以成功诱导内皮细胞产生胰岛素抵抗。与正常HUVEC相比,irHUVEC体积变大,边界模糊,形态异常;当细胞用高糖和高胰岛素分别诱导24h和48h时,irHUVEC的葡萄糖消耗量分别减少20%和31%,并且糖原合成分别减少了55%和64%,差异都具有显著性;同时,过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)和还原型一氧化氮合酶(eNOS)的表达均降低。CGRP可以明显增加irHUVEC葡萄糖的消耗量约20%和糖原合成增加约70%,并能增加PPARγ和eNOS蛋白及mRNA表达;SQ22536(cAMP阻断剂)能使PPARγ和eNOS的蛋白和基因表达量明显减少。结论:CGRP可以改善内皮细胞的胰岛素抵抗,其机制可能与上调环磷酸腺苷(cAMP),增加PPARγ和eNOS表达有关。

降钙素基因相关肽对人支气管上皮细胞分泌MMP-9的影响

目的:探讨降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide,CGRP)对人支气管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)/明胶酶B的影响及其机制。方法:采用逆转录聚合酶链式反应及明胶酶谱法,观察给予不同浓度的CGRP(10-10～10-6mol/L)刺激及CGRP10-6mol/L刺激后不同时间点(6,12,18,24,36和48h)MMP-9活性和基因表达量的变化。结果:体外培养的人支气管上皮细胞能分泌MMP-9;CGRP干预呈剂量及时间依赖方式上调人支气管上皮细胞MMP-9的活性和MMP-9 mRNA的表达(P<0.01);CGRP上调人支气管上皮细胞MMP-9活性和表达的作用可为蛋白激酶C阻断剂H-7及钙调蛋白阻断剂W-7部分逆转(P<0.05)。结论:CGRP可明显上调人支气管上皮细胞MMP-9的活性和表达,其胞内信号转导机制与蛋白激酶和钙调蛋白信号途径有关。

消化性溃疡相关基因研究进展

目前,关于消化性溃疡的研究已经从细胞水平发展到了分子水平,越来越多的与消化性溃疡相关的基因被发现,包括人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、凋亡、降钙素和三叶肽基因.这些基因在消化性溃疡的发病及愈合过程中发挥重要的作用,为临床诊断、治疗消化性溃疡提供了理论依据.

人胎十二指肠神经肽分布和发育的研究

目的 研究人胎十二指肠壁P物质 (SP)和降钙素基因相关肽 (CGRP) IR肽能神经的分布和发育规律。方法 ①苏木精 -伊红染色 ;②免疫组织化学ABC法。结果 第14周开始 ,胎儿十二指肠壁黏膜下层、肌层间结缔组织中偶见SP能、CGRP能神经纤维及神经元免疫反应产物 ,反应渐强 ,神经元从浅棕色到深棕色 ,神经纤维呈串珠状或点线状。从SP、CGRP免疫组织化学相邻切片上看 ,两者部分存在共存现象。结论 人胎十二指肠壁存在SP IR、CGRP IR能神经 ,黏膜下和肌间神经丛存在SP IR、CGRP IR肽能神经元和神经纤维 ,它们在发生、分布上有差异。

发育中的人胎小肠神经肽的研究

目的 研究人胎小肠壁P物质 (SP)和降钙素基因相关肽 (CGRP) IR肽能神经的分布和发育规律。方法 苏木精伊红 (HE)染色和免疫组织化学ABC法。结果 在胎儿发育过程中 ,小肠组织形态及其神经肽的发生、分化出现明显的变化 ,其分化由十二指肠向空肠、回肠依次进行。第 14周开始 ,胎儿小肠壁粘膜下层、肌层间结缔组织中偶见SP能、CGRP能神经纤维及神经元免疫反应产物 ,第 34周至 38周时反应最强 ,神经元从浅棕色到深棕色 ,神经纤维呈串珠状或点线状。从SP、CGRP免疫组织化学相邻切片上看 ,两者部分存在共存现象。结论 人胎小肠壁存在SP IR、CGRP IR肽能神经 ,粘膜下和肌间神经丛存在SP IR、CGRP IR肽能神经元和神经纤维 。

降钙素基因相关肽对人支气管上皮细胞E-钙粘素表达的影响

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对臭氧(O3)应激后人支气管上皮细胞(HBECs)中E-钙粘素(E-cd)表达的影响及机制。方法:采用RT-PCR检测E-cd mRNA的表达,免疫细胞化学染色法检测E-cd蛋白的表达。结果:CGRP呈剂量依赖性增加正常以及O3应激后HBECs胞膜上E-cd的表达,而对胞浆内E-cd的表达无明显影响;CGRP对HBECs胞膜上E-cd表达的上调作用可分别被H-89(PKA抑制剂)、H-7(PKC抑制剂)及W-7(CaM抑制剂)部分逆转。结论:CGRP可剂量依赖性增加正常和O3应激后HBECs胞膜E-cd的表达,而对胞浆内E-cd的表达无影响。

降钙素促进人牙周膜干细胞的胶原合成和成骨作用

目的考察降钙素(CT)促进人牙周膜干细胞(hPDLSC)的胶原合成和成骨作用。方法将50名成人受试者分为慢性牙周炎(CP)组(n=25)和对照组(n=25)。CP组中,选择探诊深度≥5 mm的上颌前部和有骨丢失影像学证据的部位,从每例患者的6个上颌位点收集龈沟液(GCF)样本。对照组中,对没有炎症的多个部位(每名受试者10~12个)进行取样以确保收集足够量的GCF。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GCF中CT、转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白(BMP)2/4/7的表达,通过Spearman相关分析考察CT表达与临床参数牙周袋探诊深度(PD)、临床附着丧失(CAL)和牙龈指数(GI)及上述指标的相关性。用携带CT基因的重组腺病毒(Ad.CT)感染hPDLSC,并通过实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测TGF-β1、BMP2/4/7、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)和Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白(ColⅠ/Ⅲ)的mRNA和蛋白质表达。结果 CP组患者GCF中CT表达水平高于对照组[(32.62±1.46)ng/mL vs(17.70±0.76)ng/mL,P<0.01)]。CP组患者CT表达与临床参数PD、CAL、GI呈负相关(P<0.01、P<0.05)。CP组患者GCF中BMP2/4/7和TGF-β1的表达水平均高于对照组[BMP2:(138.67±4.04)ng/mL vs(103.96±2.78)ng/mL;BMP4:(155.53±3.55)ng/mL vs(133.15±2.92)ng/mL;BMP7:(106.59±2.85)ng/mL vs(90.22±1.56)ng/mL;TGF-β1:(105.92±3.40)ng/mL vs(89.85±2.42)ng/mL;P均<0.01],且CP患者上述指标均与CT表达呈正相关(P<0.01、P<0.05)。腺病毒感染的CT过表达使hPDLSC中TGF-β1、ColⅠ/Ⅲ及成骨细胞标志物BMP2/4、ALP和OCN表达增加(P均<0.01)。与Ad.CT和空载腺病毒共同感染的细胞相比,用Ad.CT和特异性阻断TGF-β1小干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒(Ad.TGF-β1 siRNA)共同感染的细胞胶原蛋白表达水平更低(ColⅠ:0.16±0.02 vs 0.22±0.03;ColⅢ:0.11±0.01 vs 0.15±0.02;P均<0.01)。与Ad.CT感染的细胞相比,Ad.CT和头蛋白共处理细胞中ALP和OCN的蛋白质表达水平更低(ALP:0.19±0.02 vs 0.25±0.03;OCN:0.13±0.01 vs0.19±0.02;P均<0.01)。结论 CT通过TGF-β1和BMP信号转导途径促进hPDLSC的胶原合成和成骨作用。

大肠杆菌偏嗜性密码子组成的人降钙素(hCT)编码序列的克隆

目的:克隆适于在大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)中表达的人降钙素(hCT)基因,为提高其表达水平奠定基础。方法:根据大肠杆菌密码子频率表,在不改变hCT氨基酸组成的前提下,设计并合成适于在大肠杆菌中表达的编码hCT的DNA序列,经PCR扩增后,与质粒载体pGEM-Teasy进行连接。连接产物转化感受态JM109大肠杆菌,筛选阳性菌落,经扩大培养后,对所含重组质粒进行鉴定。结果:经酶切鉴定及DNA序列分析证实,hCT编码DNA序列成功地克隆入pGEM-Teasy载体中,其序列与设计的完全一致。结论:完成了大肠杆菌偏嗜性人降钙素基因的克隆,为下一步hCT表达载体的构建及在大肠杆菌中进行表达的研究奠定了基础。

降钙素上调TGF-β表达促牙周膜细胞增殖及胶原合成的研究

目的:研究降钙素(CT)对人牙周膜细胞(PDLCs)的增殖、胶原合成的影响及调控途径。方法:采用含CT开放阅读框序列的重组腺病毒Ad.CT转染PDLCs,并以转染空病毒Ad.Null的PDLCs作为对照,分别用流式细胞术检测细胞周期、定量PCR和Western blot检测CT、胶原(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型)、TGF-β的mRNA及蛋白的表达;Ad.CT转染PDLCs同时给予TGF-β抑制剂LY2109761干预,分别检测细胞周期及其胶原的表达水平。结果:转染Ad.CT后PDLCs中CT表达水平较对照组显著升高(P<0.05),G2/S/M期细胞比例显著高于对照组(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白以及TGF-β的表达显著高于对照组(P<0.05)。LY2109761能显著逆转Ad.CT对于PDLCs增殖及胶原合成的促进作用。结论:CT可能通过TGF-β途径促进PDLC细胞的增殖及胶原的合成。