人类α-actin启动子真核表达载体的构建及应用

利用PCR技术克隆了人类α-actin基因的启动子（约450bp），尝试用去掉启动子的pEGFP—N1作为框架结构，成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-α-actin—P。应用Lipofectamine 2000将所构建的pEGFP-N1-α-actin-P转染入小鼠ES细胞。通过比较，发现在本实验室条件下，质粒DNA浓度以3．0～5．0μg／mL，转染时间约在2～3h最佳。200μg／mL的G418较适宜于靶细胞的转染与筛选。得到表达心肌a—actin和GFP的小鼠ES细胞，基本维持小鼠ES细胞的形态。PCNA染色结果表明，转染后的小鼠ES细胞具有增殖能力。α—actin抗体免疫组化染色结果表明，转染后细胞表达α-actin和GFP，揭示构建的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P转染小鼠ES细胞，可能促进其向心肌细胞分化并对其筛选。

人类α-actin启动子真核表达载体的构建

目的利用PCR技术克隆了人类-αactin基因的启动子(约450 bp)。方法将PCR产物连接到pMD-18T载体上,酶切鉴定后测序,并进行软件分析。结果与结论序列分析表明,扩增片段虽然与GenBank里登陆的序列同源性仅为72%,但包含有完整的启动子元件和转录专一调节因子相应的识别序列。用去掉启动子的pEGFP-N1作为框架结构,尝试构建真核表达载体,并获得了含人类心肌-αactin启动子的真核表达载体pEGFP-N1--αactin-P。

一种新的分化心肌细胞筛选策略:稳定表达αMHC-Bla^r-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo融合基因的人胚胎干细胞系的建立及其向心肌细胞定向分化的鉴定

心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病之一,胚胎干细胞来源的心肌细胞移植是目前治疗心肌梗死的研究热点.但是由于受到分化的心肌细胞纯度的影响,限制了心肌分化的机理研究以及临床应用.本实验构建含有心肌特异性启动子α-MHC启动的灭瘟素(Blasticidin,简称Blar)抗性基因及增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒表达载体αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo.应用慢病毒转染技术将慢病毒转染到人胚胎干细胞(hESCs),胚胎干细胞特异性启动子Rex启动mCherry和neo抗性蛋白的表达.经过G418药物筛选,建立G418和mCherry阳性的细胞系.通过PCR及流式细胞术,进一步鉴定稳定转染的hESCs细胞系;核型分析表明,该细胞系在建立过程中仍保持细胞核型的稳定.在诱导稳定转染的hESCs向心肌细胞分化的实验中,分化的心肌细胞表达心肌细胞特异的肌钙蛋白(cTnT),同时具有EGFP和Blasticidin药物筛选的双标记.本实验建立的这一细胞系可用于心肌细胞的纯化,为深入研究心肌发生发育的关键调控机制及临床应用奠定基础.