Change of Coagulation Factor Ⅷ and Antithrombin Ⅲ Activity in Bank-Stored Blood

Coagulation factor Ⅷ and antithrombin Ⅲ activity were detected in 15 health donors. It was found that antithrombin Ⅲ activity decreased obviously 12 h after blood drawing. It lost 56 % of the activity at the 3rd day, and 70 % of the activity at the 7th day. FⅧ:c showed no obvious change after 24 h, until the 3rd day. It lost 40 %-60 % of the activity after 36 h and was reduced to the 30 % of the original activity at the 5th day. Our results suggested that at the 3rd day coagulation factor Ⅷ of bank stored blood can be used to replenish antithrombin Ⅲ, while bank stored blood in one day can be used to replenish FⅧ.

LN-R和FⅧ-RAg在胃癌中的表达及意义

目的 :探讨层粘连蛋白受体 (LN -R)和人血管Ⅷ因子相关抗原 (FⅧ -RAg)在胃癌中的表达和微血管密度(MVD)计数的意义。方法 :应用免疫组织化学S -P法检测 6 8例胃癌组织中LN -R和FⅧ -RAg的表达及MVD的计数并分析其意义。结果 :LN -R阳性表达和MVD计数与肿瘤分化水平、浸润深度 (P <0 .0 1)及淋巴结转移 (P<0 .0 0 1)密切相关。不同组织学类型中LN -R的表达具有显著相关性 (P <0 .0 1) ,而MVD与胃癌组织学类型无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :LN -R和FⅧ -RAg的高表达与肿瘤分化、侵袭和转移的关系十分密切。LN -R和FⅧ

BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效.为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响.结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长;ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL).结果表明,BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.

应用凝血因子Ⅷ基因内XbaⅠ/FⅧ_(E22)RFLP对甲型血友病携带者的诊断

用FⅧ基因内第22外显子FⅧ_(E22)为探针,分析苏州地区正常人XbaI/FⅧ_(E22)RFLP,显示出9.6/4.8Kb 的多态性,频率为0.36/0.64.PIC 值为0.46。并以此为基础对1例甲型血友病携带者进行检测。

血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物产生机制及相关遗传因素研究进展

血友病A是一种发病率为1/5000的出血性疾病,目前主要的治疗方式仍为替代治疗,治疗过程中产生凝血因子Ⅷ(FⅧ)的中和性抗体(FⅧ抑制物)是本病最大的并发症之一,将大大影响疾病治疗效果。抑制物的产生是多因素共同作用的结果,包括遗传因素和非遗传因素,遗传因素是主要因素,非遗传因素为次要因素。遗传因素包括FⅧ基因突变、免疫应答基因多态性、种族、家族史、血型。本文综述血友病A患者FⅧ抑制物产生机制及相关遗传因素的最新进展。

凝血因子Ⅷ(FⅧ)在哺乳动物细胞中的表达研究

对FⅧ cDNA进行分子改建,并分别克隆到表达载体中,在多种哺乳动物细胞表达体系（CHO、BHK等）成功地获得了表达。结果证实:基因的改建可以有效的提高FⅧ在细胞中的表达。FⅧB结构域的缺失比全长FⅧ的表达量提高了3倍左右,而重链和轻链的共表达及vMF与FⅧ的共同转染使得其表达量进一步提高。与CHO表达系统相比较,FⅧ在BHK表达系统中的表达量提高了近10倍。

中国人凝血因子Ⅷ基因中Hind Ⅲ/p114.12的RFLP研究

本文对22个正常人样品,用限制性内切酶图谱技术进行了VIII因子基因内Hind III/P114.12的RFLP研究。结果表明在中国上海地区人群中,VIII因子的内含子19处存在多态性的HindIII位点,等位片段2.6kb和2.7kb的频率分别为31％和69％。

新鲜冰冻血浆凝血因子F Ⅷ浓度变化的实验研究

目的探讨新鲜冰冻血浆(FFP)在速冻前即新鲜液体血浆(FLP)及融化后在4℃存放24 h过程中凝血因子Ⅷ(FⅧ)的活性变化,为指导临床治疗提供参考依据。方法随机抽取梧州市中心血站的FLP 20份;分别留样并立即检测FⅧ,其余的放入-50℃速冻,将制备好的FFP在37℃水浴中融化后,立即在超净工作室内严格按照无菌技术要求抽取2 mL于试管内,随即进行FⅧ活性检测即为0时值,然后把血浆放入4℃冰箱,在不同时间(4、8、12、24 h)融化后分别进行检测。结果在FFP的冰冻和融化过程中FⅧ差异有统计学意义,其活性大约损失了15%左右。在融化后放置会有凝血因子活性衰减有显著性差异。结论严格按照标准操作以防FⅧ在新鲜冰冻血浆的制作和融化过程中过多损失;其融化后放置也会有FⅧ活性的衰减,为保证输血质量,尽可能融化后立即输注。

蛋白C、蛋白S、FⅫ、FⅧ与静脉血栓栓塞的相关性研究

目的探讨蛋白C、蛋白S、凝血因子Ⅻ、凝血因子Ⅷ与静脉血栓栓塞的关系。方法以2012年8月至2014年9月我院收治的静脉血栓栓塞患者为实验组(66例),以同时期在我院体检的健康成人为对照组(66例),运用法国STA-R全自动凝血仪检测实验组和对照组血浆中的蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ的活性,采用利用t检验和χ2检验分析相关数据。结果与对照组相比,实验组中蛋白C和蛋白S的活性明显降低(P<0.05),而FⅫ和FⅧ的活性明显增高(P<0.05);实验组中FⅧ出现活性异常的比率为59.09%(39例),实验组中蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ活性出现异常的比率明显比对照组高(P<0.05)。结论蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ与静脉血栓栓塞关系密切,是静脉血栓栓塞形成的高危因素。

超多人份混合血浆分馏AHF制备FⅧ∶C标准品的可行性研究

目的 用超多人份混合血浆分馏抗血友病球蛋白 (AH F)制备稳定的用于测定凝血因子 促凝活性 (F ∶C)的标准品。 方法 以 WH O第六代 F ∶ C标准品 (WH O-6)和美国国家 F ∶ C标准品 (MEGA-1)为基准 ,用一期法测定两个批号工作标准品样品的凝血因子 促凝活性 ,并标定其活性值。 结果 用 WH O-6标定时两批样品的 F ∶ C(IU/ml)分别为 19.14± 2 .73和 11.75± 2 .0 9,用 MEGA-1标定时两批样品的 F ∶ C(IU/ml)分别为 18.94± 3 .0 0和11.63± 1.2 9。同批样品分别用 WH O-6和 MEGA-1标定时 ,其促凝活性值的差异无显著性 (P>0 .0 5 )。将样品置于 -3 0℃条件下保存 6个月 ,用 MEGA-1为基准测定 ,效价未见明显改变。 结论 以已知的国际公认 F ∶ C质控标准品为基准 ,用本文所推荐的方法可从超多人份混合血浆分馏的 AH F中制备数据可靠、性能稳定的 F ∶ C检测质控和工作标准品 。

Desmoplakin与FⅧ因子在乳腺癌转移中的作用及两者的相关性

目的探讨桥粒相关转膜糖蛋白(desmoplakin)和血液凝固第Ⅷ因子(FⅧ)在乳腺癌转移中的作用及两者的相关性。方法将100例乳腺癌石蜡标本根据淋巴结转移情况分为转移组与非转移组,每组各50例。比较两组乳腺癌组织中血管与淋巴管生成情况,并探讨两组中desmoplakin和FⅧ因子表达的相关性。结果转移组乳腺癌组织中用desmoplakin和FⅧ标记的淋巴管生成数高于未转移组(P<0.05),但两组血管生成数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Desmoplakin和Ⅷ因子在转移组及未转移组乳腺癌组织中的表达均无相关性(P>0.05)。结论 Desmoplakin有望成为乳腺癌转移的检测指标。

中国血友病A患者因子Ⅷ抑制物形成特征及随访研究

目的随访研究中国血友病A患者因子Ⅷ(FⅧ)抑制物发生率和特征。方法 215例血友病A患者在24月(2007年6月至2009年6月)的连续随访中,监测FⅧ抑制物发生、变化及转归,并观察患者临床特征。结果 215例血友病A患者随访24月FⅧ抑制物累积发病率为11.6%(25/215);其中低滴度者占72%(18/25),高滴度者占28%(7/25);FⅧ抑制物阳性发生时的中位年龄为25岁(6～59岁)、累积中位暴露日为150日;15/25(60%)低滴度阳性者(中位滴度1.25BU/ml)在自然情况下于6～15月(中位10月)转为阴性,5/25(20%)高滴度抑制物者(中位滴度100BU/ml)则随访24月持续阳性,另外5/25(20%)FⅧ抑制物阳性无变化;25例FⅧ抑制物阳性者出血频率较其阴性时显著增加(P=0.025);18/25例继续应用FⅧ者,FⅧ产品用量(IU/kg·月)较前显著增加(P=0.015),但靶关节数目在24月随访期间并无增加(P=0.329)。结论我国血友病A患者FⅧ抑制物发病率和特征与欧美等国家存在差异。

非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达

为了观察非病毒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠 32D细胞系中的表达 ,将B结构域缺失(△ 76 0aa - 16 39aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV ,构建重组质粒载体 pRC/RSV hFⅧBDcDNA。经SuperFectTransfectionReagent转染小鼠 32D细胞系 ,分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性 (hFⅧ∶C)和抗原含量 (hFⅧ∶Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录。结果表明 :小鼠 32D细胞系培养上清液中的人FⅧ∶Ag最高达到了 4 5 0 .0 8毫微克 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,hFⅧ∶C最高达到了 2 .0 1单位 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,RT PCR可检测到 32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA。结论 :非病毒质粒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠 32D细胞系中表达人FⅧ蛋白 ,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性。

超大孔离子交换制备色谱分离纯化高活性凝血因子Ⅷ

建立了一条从人血浆中分离高活性凝血因子Ⅷ(FⅧ)的纯化工艺。基于FⅧ和介质孔径的尺度比及其对蛋白质活性影响的分析,设计了以超大孔离子交换制备色谱为核心步骤的新型分离纯化工艺。分别进行超大孔离子交换色谱与传统离子交换色谱的条件优化,并对优化工艺所得产品进行了活性检测(底物显色法)和纯度检测(高效凝胶过滤和凝胶电泳)。结果表明,超大孔介质结构不但可以有效地保护蛋白质大分子结构,而且能够大幅度地提高制备色谱的传质速率,从而得到具有高凝血活性的FⅧ产品。FⅧ在超大孔制备色谱过程中的回收率(85%)比传统离子交换制备色谱高4～5倍,产品比活高达154 IU/mg。此外,还研究了超大孔介质的再生程序,采用5个柱体积的1 mol/L NaOH低流速清洗色谱柱,保证了色谱工艺的稳定性。本纯化工艺步骤简单,重现性好,易于放大生产。

B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达

本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体,观察其在293T细胞中的表达情况。用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534bp的特异性片段。结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A。

蛋白C、抗凝血酶及凝血因子Ⅷ活性变化与肺癌合并肺栓塞后治疗的关系

目的探讨蛋白C（PC）、抗凝血酶（AT）及凝血因子Ⅷ（FⅧ）活性变化与肺癌合并肺血栓栓塞[简称肺栓塞（PE）]后治疗的关系.方法选择肺癌合并PE患者（肺癌＋PE组）98例及肺癌患者（肺癌组）100例.记录两组性别、年龄并检测脂蛋白（a）[Lp（a）]、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、C反应蛋白（CRP）、凝血酶时间（TT）、血小板数量（PLT）、纤维蛋白原（Fbg）等指标.检测肺癌＋PE组治疗5～7d及肺癌组入院时的PC、AT、FⅧ、D-二聚体水平.应用Logistic回归分析肺癌合并PE后治疗5～7d凝血纤溶状态的影响因素,并采用受试者工作特征（ROC）曲线分析影响因素的诊断效能.结果肺癌＋PE组Lp（a）、TC、TG、TT均明显高于肺癌组（P〈0.05）.肺癌＋PE组PC、AT、FⅧ、D-二聚体水平明显高于肺癌组（P〈0.01）.Logistic逐步回归及ROC曲线分析显示,PC、AT、FⅧ是肺癌合并PE后治疗5～7d凝血纤溶状态的影响因素,ROC曲线下面积均〉0.90.结论肺癌合并PE中期治疗需关注PC、AT、FⅧ对凝血纤溶系统的影响,其活性水平可用来评估-定时期内的治疗效果和治疗方案.

凝血因子Ⅻ及Ⅷ在主动脉夹层围术期凝血功能中的作用研究

目的探讨凝血因子Ⅻ及凝血因子Ⅷ在主动脉夹层手术患者围术期的变化及对二次开胸的影响。方法选取2014年1月至2015年9月于首都医科大学附属北京安贞医院就诊的Stanford A型主动脉夹层患者88例,均接受中度低温停循环手术治疗。根据是否二次开胸将88例患者分为二次开胸组(10例)和未二次开胸组(78例),比较2组患者手术及术后重要指标,分析凝血功能障碍导致二次开胸的危险因素。选择麻醉诱导后(t1)、术中温度最低点(t2)、复温至36℃(t3)、术后4 h(t4)、术后24 h(t5)5个时点进行血液样本的抽取,应用酶联免疫吸附法进行凝血因子Ⅻ、活化的凝血因子Ⅻ、凝血因子Ⅶ、活化的凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、活化的凝血因子Ⅷ、血红蛋白、血小板计数的检测。结果t2~t4时点凝血因子Ⅻ水平均低于t1,差异均有统计学意义(均P<0.05),t5时点与t1比较差异无统计学意义(P=0.065)。活化的凝血因子Ⅻ和活化的凝血因子Ⅷ水平由t1~t5全程呈逐渐升高趋势,与t1比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。凝血因子Ⅷ水平各时点均低于t1,差异均有统计学意义(均P<0.05)。凝血因子Ⅶ水平于t2和t3时点均低于t1,t4和t5时点均高于t1,差异均有统计学意义(均P<0.05)。二次开胸组术中失血量、术后总引流量以及悬红细胞输注总量、冰冻血浆输注总量、纤维蛋白原输注总量均高于未二次开胸组[1 700(1 375,2 000)ml比1 250(1 000,1 600)ml;4 250(2 533,7 060)ml比2 170(1 230,3 555)ml;2 700(1 125,3 825)ml比675(600,1 424)ml;1 200(400,1 550)ml比400(50,800)ml;2.00(2.00,2.88)g比2.00(1.00,2.00)g],t2时点血小板计数水平低于未二次开胸组[(61±28)×109/L比(72±39)×109/L],差异有统计学意义(P<0.05)。在校正体质量、体外循环时间、手术时间、低温停循环时间、术前血小板水平、术前血红蛋白水平等因素的影响后,多元Logistic回归分析发现,t2时点凝血因子Ⅻ水平(比值比=1.342,95%置信区间:1.058~1.570,P=0.012)为主动脉夹层患者接受外科手术后凝血功能障碍导致二次开胸的独立危险因素。结论凝血因子Ⅻ作为内源性凝血途径的启动因子,在主动脉夹层患者围术期的凝血功能中发挥着巨大作用,其在术中最低温时的水平较低可能是术后由于凝血功能障碍导致二次开胸的独立危险因素;而凝血因子Ⅷ作为凝血共同途径的重要因子,本研究未发现其增加二次开胸的风险。

人凝血因子ⅧcDNA在小鼠体内的转染与表达

本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺 胺型 (PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ (FⅧ )基因在小鼠体内的转染和表达 ,并与体外转染方法作比较。应用含B区缺失 ( 76 0aa- 16 39aa)人FⅧcDNA(FⅧBDcDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体 pLNC FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC FⅧBD ,exvivo转染小鼠骨髓基质细胞 ,同时将 pLNC FⅧBD与PAMAM树枝状聚合物按照 1∶15混合以形成复合体PAMAM pLNC FⅧBD进行小鼠invivo转染。分别于注射后第 2 4 ,4 8小时 ,第 1,2 ,3,4周取血 ,分离血浆 ,采用一期法测定人FⅧ活性 (FⅧc) ,ELISA法测定人FⅧ抗原 (FⅧAg) ,并采用Bethesdainhibitorassay测定人FⅧ抗体 ;同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA ,进行RT PCR ,观察各组织的转录 ,并用苏木素 伊红染色法观察各组织的形态学改变。结果表明 ,逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后 ,可以在体内继续表达人FⅧ ,并且能有效地分泌至血液中。宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续 3周以上 ,注射后第 2 4小时表达最高水平 ,人FⅧAg平均为 8.6ng/ml,此后人FⅧ抗体逐渐生成 ,人FⅧAg水平渐低 ,于注射后第 4周不再能测出人FⅧAg。注射复合体PAMAM pLNC FⅧBD在体内转染后 ,获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达 ,在注射?

中和低剂量重组人凝血因子Ⅷ防治血友病A关节出血的疗效

目的 比较中、低剂量重组人凝血因子Ⅷ防治血友病A关节出血的临床疗效.方法将58 例血友病A患儿按预防剂量的大小分为2组：中剂量组（28例）和低剂量组（30例）.中剂量组采用重组人凝血因子Ⅷ15～25 ·kg-1静脉推注,3次周-1,连用4个月;低剂量组采用重组人凝血因子Ⅷ＜15 U·kg-1静脉推注,3次＆#183;周-1,连用4个月.观察2组防治前、防治4个月后关节出血次数的情况.结果 2组防治4个月后关节出血次数明显低于防治前（P＜0.05）,中剂量组防治4个月后关节出血次数明显低于低剂量组（P＜0.05）.结论 重组人凝血因子Ⅷ用于防治血友病A能明显改善关节出血症状,且中剂量防治优于低剂量.

215例血友病A患者因子Ⅷ抑制物形成的环境因素研究

目的研究中国血友病A患者因子Ⅷ(FⅧ)抑制物形成的环境因素。方法监测215例血友病A患者在2年(2007年6月至2009年6月)的连续随访中,FⅧ抑制物发生、变化及转归,并对FⅧ抑制物形成的环境因素进行回顾性分析。结果 215例血友病A患者随访2年FⅧ抑制物累积发生率为11.6%(25/215)。FⅧ抑制物形成的环境因素的多变量分析结果示:①输注原因中短期低剂量预防治疗比按需治疗形成FⅧ抑制物的风险低(OR=0.037,95%CI为0.002～0.616);②血友病越严重,累积暴露日越少,FⅧ抑制物形成风险越高;③发生严重出血事件是FⅧ抑制物形成的高危因素(OR=117.045,95%CI为19.333～708.617);④输注形式和发生重大感染事件与FⅧ抑制物形成无关。结论在中国目前治疗情况下,血友病患者FⅧ抑制物的形成可能与血友病严重程度、输注原因(预防治疗或按需治疗)、累积暴露日和是否发生严重出血事件有关。