三氧化二砷抗裸鼠人结肠癌移植瘤作用及其机制的研究

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)抗人结肠腺癌裸鼠移植瘤作用、作用机制以及药物毒性。方法:建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型,随机分为4组,即生理盐水组、5-氟脲嘧啶(5-FU)组、低剂量As2O3组和高剂量As2O3组,比较各组的抑瘤作用和裸鼠一般状态的变化,并对标本分别行光镜和电镜观察、原位末端标记(TUNEL)、免疫组化和血常规检测。结果:As2O3能够明显抑制结肠癌裸鼠移植瘤的增长,并能诱导癌细胞凋亡,调控相关基因表达;未见As2O3引起明显肝、肾和造血系统损害。结论:As2O3对人结肠腺癌细胞裸鼠移植瘤具有显著的抗癌作用,此作用可能与诱导癌细胞凋亡密切相关,且受到多种有关基因的调控;但是对裸鼠的肝、肾和造血系统无明显的毒性。

大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖影响及作用机制研究

目的:探讨大蒜素对体外培养结肠癌HT29细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度大蒜素对HT29细胞增殖抑制率;流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax的表达。结果:MTT显示大蒜素能抑制人结肠癌HT29细胞的增殖,并具有时间-剂量依赖性;流式细胞术测定结果显示10μg/ml大蒜素可明显诱导HT29细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G2/M期;可降低癌基因蛋白Bcl表达,而促进Bax表达。结论:大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖具有抑制作用,可能与细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白表达有关。

Caco-2单层细胞模型及其在药学中的应用

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钙通道活性与胃泌素促人结肠癌细胞增殖间关系的研究

目的 探讨钙通道活性在胃泌素促人结肠癌细胞增殖中的作用。方法 运用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子水平 ,MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 2 5× 10 -6M的五肽胃泌素 (PG)可以引起HT2 9细胞内游离钙离子水平明显升高 (P <0 0 1) ,钙通道阻滞剂nifedipine(10 -5M)可以使PG引起的钙离子水平升高幅度明显下降 (P <0 0 1)。同时可以部分抑制PG促增殖作用 (P <0 0 5 )。钙通道激动剂Bayk86 4 4 (10 -6M)可以明显升高细胞内钙离子水平 (P <0 0 1)。并能促进HT2 9细胞增殖 (P <0 0 5 ) ,与PG的促增殖作用相比无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 钙通道作为调节细胞内钙离子变化的主要途径 ,在调控PG促HT2

钙通道阻滞剂对胃泌素促人结肠癌细胞增殖的影响

目的 观察硝苯地平 ( Nif)对五肽胃泌素促人结肠癌细胞增殖的影响并初步探讨其作用机制。方法 采用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子浓度水平 (〔 Ca2 +〕i) ,结合 MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 2 .5× 10 - 6mol/ L的五肽胃泌素 ( PG)作用于 HT2 9细胞后 ,可引起〔 Ca2 +〕i 水平迅速升高 ( P<0 .0 1)。 10 - 5 mol/ L的 Nif可使 PG引起的〔 Ca2 +〕i 水平升高幅度明显降低 ( P<0 .0 1) ,同时 10 - 5～ 10 - 6mol/ L 的 Nif可以抑制 PG促 HT2 9细胞增殖的作用 ( P<0 .0 5 )。结论 Nif通过抑制胞外 Ca2 +内流 ,阻止〔 Ca2 +〕i 水平升高 ,是其抑制 PG促 HT2

粉防己碱对人结肠癌细胞增殖的影响

目的 :观察粉防己碱对人结肠癌细胞 H T2 9增殖的影响 ,并初步探讨其作用机制。方法 :采用流式细胞仪分析细胞周期变化 ,并测定细胞内游离钙离子浓度水平 ;MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 :2～ 10 μg/m L 的粉防己碱 (Tet)能明显抑制 HT2 9细胞的增殖 (P<0 .0 5 ) ,其半数抑制浓度 (IC5 0 )约为 8μg/m L。 8μg/m L 的 Tet可以使细胞内游离钙离子浓度 (〔Ca2 +〕i)水平明显降低 (P<0 .0 1)。不同浓度的 Tet可使 HT2 9细胞 C1 期或 G2 + M期明显增加 ,S期细胞明显减少 (P<0 .0 1)。结论 :粉防己碱通过抑制钙离子信号传递途径 ,使细胞周期进行受阻 ,可能是其抑制 HT2 9细胞增殖的一个主要机制。

异鼠李素诱导HCT116细胞自噬

目的研究中华补血草[Limonium sinense(Girard)Kuntz]中主要抗癌活性成分之一异鼠李素诱导人结直肠癌(HCT116)细胞自噬的机理。方法采用四唑盐比色法(MTT)检测异鼠李素对HCT116细胞的抑制作用,单丹尸磺酰胺(MDC)染色法检测自噬小泡的形成,蛋白印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果异鼠李素明显抑制HCT116细胞的增殖,且呈剂量依赖性效应。异鼠李素处理24 h后,自噬小泡形成增多,LC3蛋白表达增强。3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理能够明显降低异鼠李素对肿瘤细胞的抑制作用。结论实验结果显示中华补血草中的异鼠李素可以诱导HCT116细胞发生自噬,导致细胞死亡。

人结肠癌细胞系裸小鼠淋巴结转移的观察

目的建立人结肠癌细胞系裸小鼠爪垫淋巴道转移动物模型，并评价卡培他滨抗癌药物效果。方法裸小鼠爪垫皮下注射人结肠癌HCT-116细胞，在1～6周及8周取材，进行HE染色及CEA免疫组化检测，观察种植瘤的成瘤率、生长情况、淋巴结转移规律，并口服卡陪他滨抗癌药物观察其疗效。结果种植1周后成瘤率100％。肿瘤在3～4周成指数生长。3周时见第一级帼窝腹股沟淋巴结转移（2／5），到6周时100％转移，其中腹股沟淋巴结转移阳性率76．9％（10／13）；5周时见第二级髂血管旁淋巴结转移（1／5）；到8周时见第三级肾门淋巴结转移（1／5），髂血管旁淋巴结转移（3／5），但均未见肝肺远处转移。淋巴结转移发生在肿瘤指数生长之前，HE染色及CEA免疫组化染色证实淋巴结有弥漫性癌细胞转移浸润。口服化疗药物卡培他滨能有效抑制肿瘤生长及淋巴结转移。结论成功建立了人结肠癌裸小鼠爪垫淋巴道转移模型。此模型快速简便、转移集中、转移率高，且应用此模型能够评价抗癌药物卡培他滨抗癌疗效。

人结直肠癌耐药细胞株HT-29/CPT-11的构建及其生物学特性探讨

目的:建立耐伊立替康(CPT-11)的人结直肠癌细胞株(HT-29/CPT-11),并研究其生物学特性。方法:采用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结直肠癌耐药株HT-29/CPT-11;CCK-8法检测CPT-11对亲本细胞HT-29和耐药细胞株HT-29/CPT-11细胞的半数抑制率(IC50);绘制细胞生长曲线,并计算细胞倍增时间;流式细胞术分析细胞周期分布;RT-PCR检测HT-29/CPT-11和HT-29细胞MDR-1 mRNA的表达。结果:(1)成功建立人结直肠癌耐药细胞株HT-29/CPT-11,耐药指数为6.51。(2)HT-29/CPT-11耐药细胞株倍增时间较原代细胞HT-29延长[分别为(41.29±1.69)h和(27.12±2.73)h,P<0.05]。(3)流式细胞术检测细胞周期结果显示,耐药细胞株HT-29/CPT-11 G1期细胞数目增加,S期细胞数目减少(P<0.05)。(4)耐药细胞HT-29/CPT-11的MDR-1 mRNA表达水平明显高于亲本细胞株HT-29,分别为1.086±0.054和0.416±0.02(P<0.05)。结论:成功构建了人结直肠癌耐药细胞株HT-29/CPT-11,为下一步研究耐药机制奠定实验基础。

中成药逆转人结肠癌细胞株对化疗药物耐药的研究

目的:本研究拟观察鸦胆子油乳注射液、华蟾素注射液和注射用黄芪多糖对结肠癌耐药细胞株的杀伤作用,为临床合理、有效使用中成药提供实验依据。方法:运用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结肠癌lovo细胞耐5-氟尿嘧啶细胞株,并命名为lovo/5-Fu。MTT法检测lovo/5-Fu的耐药能力及不同浓度中成药对lovo/5-Fu细胞株的耐药逆转作用,并根据相应结果计算耐药逆转倍数(RF)。细胞迁移实验分为4组:空白对照组、黄芪多糖组、鸦胆子组和华蟾素组,检测不同中成药对lovo/5-Fu细胞株迁移能力的影响。结果:5-Fu对lovo细胞株的IC_(50)为14.5 mg/L,对lovo/5-Fu细胞株的IC_(50)为115.1 mg/L,根据上述两株细胞的IC_(50)可算出lovo/5-Fu细胞株对5-Fu的耐药指数为:7.94。浓度为17.3、45.3、83.8、112.5 mg/L鸦胆子油乳注射液的耐药逆转倍数分别为9.5、23.5、54.4、86.5倍;浓度为8.2、21.2、38.6、50.1 mg/L华蟾素注射液的耐药逆转倍数分别为11.2、25.2、56.6、90.5倍;浓度为26.3、70.9、115.2、163.4 mg/L注射用黄芪多糖的耐药逆转倍数分别为1.5、8.2、26.5、74.2倍。与空白对照组比较,黄芪多糖组、鸦胆子组和华蟾素组侵出小室的细胞数目明显减少,迁移能力明显减弱,其中以鸦胆子组和华蟾素组更为明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:鸦胆子油乳注射液、华蟾素注射液和注射用黄芪多糖这三种中成药均能不同程度的逆转lovo/5-Fu对5-Fu的耐药性,其中以鸦胆子油乳注射液和华蟾素注射液最为明显。

槲皮苷在人结肠癌上皮细胞内的吸收与代谢研究

目的研究槲皮苷在人结肠癌上皮细胞内的吸收和代谢特征。方法以人结肠癌上皮细胞为模型,采用液相色谱串联质谱法,测定人结肠癌上皮细胞上的槲皮苷及其代谢产物(包括槲皮素和3′-甲基槲皮素、4′-甲基槲皮素等)。结果 30～150min中均能在人结肠癌上皮细胞内检测到槲皮苷、槲皮素和3′-甲基槲皮素、4′-甲基槲皮素,胞内摄取呈现120min内随时间先升后降、120min达稳态的趋势特征。同时在细胞内检测到槲皮素进一步代谢产物槲皮素葡萄糖醛酸、槲皮素三硫酸酯和槲皮素葡萄糖醛酸化硫酸酯,以及3个未知产物特异吸收峰,未发现[M+H]+准分子离子峰m/z>600的代谢产物。结论槲皮苷在人结肠癌上皮细胞中以完整的糖苷形式吸收,在胞内脱糖基后进行甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等转化和代谢。

L-精氨酸经一氧化氮途径对人结肠癌细胞株LS174的增殖及iNOS表达和细胞周期的影响

目的探讨L-精氨酸经一氧化氮(NO)途径对人结肠癌细胞株LS174的增殖及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达和细胞周期的影响。方法LS174细胞经不同浓度L-精氨酸干预后,采用MTT法检测细胞增殖活性,硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO的含量,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot和免疫细胞化学染色SP法检测iNOS蛋白的表达。结果低浓度(0.125mmol/L)的L-精氨酸对LS174细胞的增殖有促进作用,高浓度(0.5、2、8及32mmol/L)的L-精氨酸对LS174细胞的增殖有抑制作用;培养液中的NO浓度伴随L-精氨酸浓度的增加而升高;与对照组相比,高浓度(0.5、2、8及32mmol/L)L-精氨酸处理48h后S期细胞比例增加(P<0.05,P<0.01),低浓度(0.125mmol/L)者差异则无统计学意义(P>0.05);随着L-精氨酸浓度的增加,iNOS蛋白的表达较对照组有增高趋势,浓度越高,效果越明显。结论L-精氨酸通过诱导iNOS的表达,可提高NO的生成;低浓度的L-精氨酸对LS174细胞的增殖有促进作用,高浓度的L-精氨酸对LS174细胞的增殖有抑制作用;高浓度的L-精氨酸诱导细胞周期停滞于S期。

钙通道活性与胃泌素促人结肠癌细胞增殖间关系的研究

目的 :探讨钙通道活性在胃泌素促人结肠癌细胞增殖中的作用。方法 :运用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子水平 ,MTT比色法测定细胞增殖情况。结果 :2 5× 10 -6M的五肽胃泌素 (PG)可以引起HT2 9细胞内游离钙离子水平明显升高 (P <0 0 1) ,钙通道阻滞剂nifedipine (10 -5M)可以使PG引起的钙离子水平升高幅度明显下降 (P <0 0 1)。同时可以部分抑制PG促增殖作用 (P <0 0 5 )。钙通道激动剂Bayk86 44 (10 -6M)可以明显升高细胞内钙离子水平 (P <0 0 1)。并能促进HT2 9细胞增殖 (P <0 0 5 ) ,与PG的促增殖作用相比无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :钙通道作为调节细胞内钙离子变化的主要途径 ,在调控PG促HT2

凋亡素基因对人结肠癌细胞作用的研究

目的探讨凋亡素基因的导入对人结肠癌细胞的影响。方法将凋亡素基因VP3克隆入真核表达载体pEGFP-C2,构建成重组质粒pEGFP-VP3。用脂质体转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分组分别转染人类结肠癌细胞(Lovo)和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3),通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同组细胞中的定位、表达及细胞的生长、凋亡情况,MTT法测定不同组细胞的生长曲线,并用An-nexinV-FITC流式细胞技术检测细胞的凋亡率。结果在Lovo/EGFP组和3T3/EGFP-VP3组细胞中,EGFP均匀分布于细胞中,细胞形态无明显变化,细胞凋亡率较非转染细胞组亦无明显增加。而在Lovo/EGFP-VP3组细胞中,EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核,并逐渐变粗,最后细胞碎裂成片状,流式细胞技术检测Lovo/EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于其他对照组(P<0.01)。结论pEGFP-VP3可诱导人类结肠癌细胞凋亡。

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立及其差异表达基因的筛选

目的:建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关基因.方法:采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线:用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR方法对筛选出的部分耐药相关基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证.结果:LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大.LoVo/5-FU对5-FU、ADM、MMC耐药,而对CDDP无耐药性(RI:7.69,2.78,1.43和0.96).通过基因芯片筛选出差异表达基因425个,可能的耐药相关基因包括CYP1B1,NAT2,RNF20,SNAI2,MAP3K2,其中CYP1B1在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异(Cy5/Cv3=5.877).结论:LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与CYP1B1,NAT2等耐药相关基因有关.

染料木黄酮联合5-FU对结肠癌HCT-116细胞株增殖及凋亡的影响

目的探讨染料木黄酮联合5-氟尿嘧啶对HCT-116细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法经不同浓度的Gen和(或)5-FU处理HCT-116细胞后,用MTT法检测细胞的生长抑制效应;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期变化情况;RT-PCR检测Suvivin表达水平。结果 Gen与5-FU联合应用后能明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,使细胞发生S期阻滞,均较对照组和单用药组作用增强,并且下调了Suvivin的mRNA表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Gen可抑制结肠癌HCT-116细胞的增殖,将细胞阻滞于S期,并诱导细胞的凋亡,与5-FU联合应用具有显著协同效应,其机制可能与下调Suvivin表达有关。

复方肠泰抑制人结肠癌SW480细胞增殖的实验研究

目的:考察复方肠泰(人参、薏苡仁、莪术等)对人结肠癌细胞SW480细胞生长的抑制作用及其对细胞增殖周期和凋亡的影响。方法:采用噻唑蓝比色法测定不同浓度复方肠泰在不同作用时间内对在体外培养SW480细胞增殖的影响,同时应用流式细胞术检测细胞增殖周期及凋亡率的变化。结果:复方肠泰可在G0/G1期以及G2/M期阻滞人结肠癌细胞SW480的增殖,使S期细胞比率降低。结论:复方肠泰在3.51～7.81mg/mL范围内呈现明显的量效关系。

人结肠癌细胞Dickkopf-1的表达水平及意义

目的检测六株结肠癌细胞中Dickkopf-1(DKK1)的表达并探讨其意义。方法在6株结肠癌细胞(SW480、SW620、HT29、LS174T、LOVO、HCT116)分别应用qPCR方法检测DKK1的mRNA表达水平。用Western blot方法和细胞免疫组化方法检测DKK1的蛋白表达情况。结果荧光定量分析显示,DKK1在HT29、HCT116中的表达高于其他四株细胞(P<0.05);Western blot显示,DKK1在HCT116、HT29中的表达同样高于其他四株细胞;细胞免疫组化染色显示,DKK1在六株结肠癌细胞株中呈阳性表达。结论 DKK1在6株人结肠癌细胞系中的表达具有差异性。

抗癌药对人结肠癌细胞株P53蛋白表达的影响

采用 PCR- DNA序列分析方法检测 6例人结肠癌细胞株 p5 3基因突变及突变位点 ,应用免疫组化方法检测上述细胞 P5 3蛋白改变 ,结果表明 :6例细胞株中 ,4例显示 p5 3基因突变 ,P5 3蛋白亦呈阳性表达 ,其余 2例则为阴性。对两种方法检测均呈阳性者 ,再进行抗癌药物处理 ,结果显示 :P5 3蛋白表达强弱与药物作用时间长短有关 ,经药物作用 2 h者 ,P5 3蛋白表达明显减低 ,作用 10 h者 ,蛋白表达更加减弱 ,说明抗癌药物对 P5

Caco-2建立肠黏膜屏障模型及其在通透性研究中的应用

目的利用Caco-2细胞建立体外肠黏膜屏障模型，系统评价并初步探讨其在炎症损伤后黏膜通透性改变中的应用。方法体外培养Caco-2细胞，接种于Transwell板上，每日观察细胞形态；自培养第5天起，隔日测细胞膜的跨上皮电阻（transepithelialelectricalresistance，TEER）；对于TEER值达标准的孔测定荧光黄透过率，进行透射电镜的完整性验证。应用培养21d的Caco-2细胞屏障，加入不同浓度（0、50、100、200nmoWL）的血小板活化因子（platelet—activatingfactor，PAF）孵育24h，光镜、电镜观察形态学改变，检测TEER和荧光黄透过率，应用间接免疫荧光和Westernblot观察ZO-1蛋白的分布及表达。结果Caco-2细胞单层TEER从第5～15天逐渐增加，在第15天已经达到600Ω·cm2，平台期保持至第21天；在此期间，细胞形成紧密单层，电镜下细胞呈高分化，细胞间形成紧密连接，绒毛整齐，极性形成；荧光黄透过量极低，体外肠上皮细胞屏障形成。加入PAF后，以100nmoVL对黏膜屏障通透性影响最大：电镜下见紧密连接结构破坏、断裂，细胞表面微绒毛脱落、稀疏；免疫荧光可见紧密连接的标志蛋白ZO-1荧光信号减弱，ZO-1环断裂，胞浆内可见阳性染色，提示其向膜下转移。此时，TEER值下降，荧光黄透过量明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），与形态学改变规律一致；ZO—1蛋白表达亦降至最低，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论经形态学及细胞通透性验证，培养2～3周的Caco-2细胞可形成肠屏障模型，用于体外肠黏膜屏障的研究；PAF影响紧密连接相关蛋白的表达，破坏紧密连接结构，从而影响肠黏膜屏障通透性。