猪导入人类促衰变因子(hDAF)的整合与表达

将人类促衰变因子 ( human decay accelerating factor,h DAF)基因显微注入 51 7枚猪的受精卵 ,移植到2 6头受体母猪的输卵管内。 2 1头怀孕 ,产仔 93头。产仔后 ,取仔猪的耳或尾组织 ,提取总 DNA。以 5′-TGGCGAGAAGGACTCAGTGATCT-3′和 5′-TGAACTGTTGGTGGGACCTTGGA-3′为引物 ,进行 PCR扩增 ,有 1 8头显示阳性。转基因效率为 3 .5%( 1 8/ 51 7)。对存活的 1 4头转基因猪用免疫荧光法进行检测 ,并采用 MPIAS-50 0多媒体彩色病理图文分析系统进行图像分析 ,其中有 7头的动脉肌肉层中显现有荧光 ,其平均灰度在 1 2 7.3～ 1 70 .

人衰变加速因子在酵母细胞表面的呈现

目的为获得能在酵母表面正确折叠的人衰变加速因子。方法通过 PCR技术从 DAF- p Bluescript M13- (Amp+ )质粒扩增出全长的 DAF c DNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体 p YD1,构建 DAF- p YD1重组质粒 ,转化酵母细胞 ,流式细胞仪检测所呈现的 DAF。结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有 DAF分子的表达 ,并且此表面呈现的 DAF与针对DAF不同表位的 3株单抗均能结合。结论酵母表面呈现的 DAF保持了天然 DAF分子的构象 ,为进一步构建

基于人DAF框架的酵母展示肽库的构建与鉴定

以hDAFcDNA为模板 ,用随机引物分别通过大引物PCR和交叠PCR方法引入突变 ,酶切后克隆到酵母表面展示载体pYD1 ,构建DAF pYD1重组质粒 ,转化酵母细胞 ,PCR鉴定随机性 ,流式细胞仪分析DAF的表达。结果表明 ,随机性达到理论要求 ,通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有DAF分子的表达。以上结果表明 ,成功构建了基于DAF框架的酵母表面展示肽库 ,为进一步筛选DAF的突变体库奠定了基础。