Application of dental stem cells in three-dimensional tissue regeneration

Dental stem cells can differentiate into different types of cells.Dental pulp stem cells,stem cells from human exfoliated deciduous teeth,periodontal ligament stem cells,stem cells from apical papilla,and dental follicle progenitor cells are five different types of dental stem cells that have been identified during different stages of tooth development.The availability of dental stem cells from discarded or removed teeth makes them promising candidates for tissue engineering.In recent years,three-dimensional(3D)tissue scaffolds have been used to reconstruct and restore different anatomical defects.With rapid advances in 3D tissue engineering,dental stem cells have been used in the regeneration of 3D engineered tissue.This review presents an overview of different types of dental stem cells used in 3D tissue regeneration,which are currently the most common type of stem cells used to treat human tissue conditions.

芒柄花素促进牙囊干细胞成骨向分化

目的:研究芒柄花素对牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,hDFSCs)成骨分化的影响。方法:首先对hDFSCs进行分离、培养及鉴定,并使用含不同浓度芒柄花素(0、0.1、1、10μmol/L)培养基培养细胞。通过CCK-8实验、结晶紫染色和活/死细胞荧光染色评估细胞的活性状况;通过细胞骨架荧光染色观察细胞骨架状况;采用RT-qPCR检测细胞成骨相关基因的表达变化;利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测法评估细胞成骨分化过程中ALP活性的影响;通过茜素红染色法评估细胞成骨分化过程中钙化结节数量的影响。结果:hDFSCs具有干细胞特性;不同浓度的芒柄花素对hDFSCs活性无显著性影响;1μmol/L的芒柄花素可显著促进Runx2、OCN、Col-Iα1的mRNA表达;并能够提高的细胞内ALP活性和钙化结节的数量。结论:1μmol/L芒柄花素可促进hDFSCs的成骨分化。

人牙囊细胞的分离培养和生物学特性

目的 :应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性。方法 :分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织 ,消化法获得人牙囊细胞 ,HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达 ,RT -PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达。结果 :原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态 ,有部分上皮成分混杂 ,经纯化后可排除 ;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性 ,定位于细胞的胞质中 ;RT -PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。结论 :体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性 ,具有合成Ⅰ型胶原的能力 ;不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白。

人牙囊细胞的培养及其特性

目的 :体外培养人牙囊细胞并研究其特性。方法 :取年龄为 12岁人埋藏阻生第三磨牙的牙囊 ,组织块法进行人牙囊细胞的培养 ,HE染色、扫描电镜观察人牙囊细胞的形态 ,免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及波形蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果 :培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形 ,形似成纤维细胞 ;扫描电镜可见细胞多呈梭形 ,也可见多角形 ,所有细胞表面均有颗粒状物质 ,有的细胞表面多且密 ,有的细胞表面较少 ,折光性较强 ,细胞核周围分布较多 ;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形蛋白的表达呈阳性 ,定位于细胞的胞质中 ,围绕细胞核周围染色较强 ,细胞核内染色阴性。结论 :体外可以培养人牙囊细胞 ,人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性 。

体外共培养人牙髓干细胞对人牙囊干细胞增殖、成骨分化的作用

目的通过体外建立人牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,HDFSCs)和人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)共培养体系,研究HDPSCs对HDFSCs增殖、成骨分化的作用。方法 1利用改良的组织块-消化联合法、免疫组化方法、流式细胞术以及多向诱导方法对HDFSCs和HDPSCs进行分离、培养、鉴定;2采用0.4μm孔径的Transwell小室构建HDFSCs和HDPSCs体外共培养体系;3CCK-8测定HDFSCs增殖活性的变化;4与HDPSCs体外共培养1周,qRTPCR检测HDFSCs几个标志性成骨基因:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、人类相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)以及Ⅰ型胶原(collagen type 1,Col-1)的表达情况。结果 1成功分离、培养、鉴定HDFSCs和HDPSCs;2从第4天开始,共培养组HDFSCs的增殖活力明显高于对照组(P<0.05);3与对照组相比,共培养组ALP、Runx2、OPN、BSP、Col-1的相对表达量均明显增高(P<0.05)。结论与HDPSCs共培养能增强HDFSCs增殖活力及成骨分化。

集落刺激因子在人牙囊细胞中的表达

目的 :研究体外培养的人牙囊细胞中集落刺激因子 (CSF - 1)表达及定位 ,以及不同浓度的IL - 1α对牙囊细胞分泌CSF - 1的影响 ,探讨CSF - 1在牙齿萌出中的作用。方法 :取 12岁患者因正畸需要拔除的埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养 ,用免疫组织化学染色技术 ,观察CSF - 1在细胞中的表达及定位。使用ELISA方法观察 0～ 10 0ng/ml的五个不同浓度的IL - 1α对培养的牙囊细胞分泌CSF - 1的影响。结果 :培养的人牙囊细胞呈梭形 ,主要为成纤维样细胞 ,在牙囊细胞中CSF - 1的表达呈阳性 ,定位于细胞的胞质中 ,围绕细胞核周围染色较强 ,细胞核内染色阴性 ,细胞外未见阳性表达。培养细胞加入IL - 1α后 ,CSF - 1的浓度明显增加并随IL - 1α浓度的增加而增加。结论 :培养的人牙囊成纤维样细胞具有合成与分泌CSF - 1的能力 ,IL - 1α可以促进体外培养的人牙囊细胞CSF - 1的分泌。

人牙囊细胞中表皮生长因子的表达以及流体静压力下的改变

目的:研究体外培养的人牙囊细胞EGF的表达以及在不同流体静压力作用下对细胞分泌EGF的影响,探讨EGF在牙齿萌出过程中的作用。方法:取年龄为12岁男孩埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,将传代的培养细胞应用原位杂交的方法表达EGF,RT-PCR定量分析,分别在50、100kPa流体静压力作用1h后RT-PCR方法观察细胞EGF的浓度变化。结果:培养的人牙囊细胞呈梭形,主要为成纤维样细胞,原位杂交染色显示人牙囊细胞中EGF的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中,50kPa流体静压力表达略有增加,100kPa压力表达明显降低,说明流体静压力在一定力值范围内对人牙囊细胞中有EGF的表达具有空间性。结论:培养的人牙囊细胞具有合成与分泌EGF的能力,流体静压力可以影响体外培养的人牙囊细胞EGF的分泌。

BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG和RANKL的影响

目的:研究BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG和RANKL的影响。方法:第5代人牙囊细胞免疫组化染色,检测人牙囊细胞中OPG和RANKL蛋白的表达;第5代人牙囊细胞与浓度为100ng/ml的BMP-2共同孵育0h、1h、3h、6h、12h、18h,RT-PCR法检测OPG和RANKL基因表达的变化。结果:人牙囊细胞OPG、RANKL免疫组化染色阳性;100ng/ml的BMP-2上调OPG蛋白的分泌,最佳效应时间为12～18h,下调RANKL基因的表达,最佳效应时间为6～12h。结论:人牙囊细胞存在OPG、RANKL蛋白的表达;100ng/ml的BMP-2可增强人牙囊细胞OPG蛋白分泌和基因表达,减弱RANKL基因的表达,降低RANKL/OPG的比值,抑制破骨细胞的形成。

牙本质基质对牙囊细胞增殖分化影响的体外研究

目的：研究牙本质基质（DM）对人牙囊细胞（h PFCs）增殖、分化的影响。方法：酶消化组织块法分离培养hDFCs,经鉴定后取第4代细胞并将其随机分为2组,分别用DM浸提液（实验组）和α-DMEM培养液（对照组）进行培养。然后分别用CCK-8法检测各组细胞在培养后1~7 d各时间点的增殖情况;用Western-blot检测培养7 d后各组细胞中ALP、Runx2、OPN、CP-23各成骨/成牙骨质相关基因的蛋白表达水平。结果：DM浸提液对h DFCs的增殖无明显促进作用（P〉0.05）,但能明显上调其ALP、Runx2、OPN、CP-23蛋白表达水平（P〈0.05）。结论：牙本质基质浸提液可诱导hDFCs向成骨/成牙骨质向分化。

体外培养人牙囊细胞Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的表达

目的 :通过体外培养人牙囊细胞 ,研究Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白在细胞中的表达 ,探讨其在牙齿萌出过程中转化为牙周膜细胞的机制。方法 :取 12岁患者因正畸需要拔除埋藏阻生牙齿的牙囊 ,组织块法进行人牙囊细胞的培养 ,通过免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及纤维粘连蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果 :培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形 ,形似成纤维细胞。在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和纤维粘连蛋白的表达呈阳性 ,定位于细胞的胞质中 ,围绕细胞核周围染色较强 ,细胞核内染色阴性。结论 :体外培养人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性 ,具有合成与分泌Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的能力。

白细胞介素-10对人牙囊细胞RANKL表达的影响

目的:研究人牙囊细胞白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)蛋白的表达及其对破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)表达的影响。方法:采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞,进行IL-10免疫组化染色。25ng/mlIL-10作用于牙囊细胞0、1、3、6 h,用RT-PCR检测RANKL mRNA表达的变化。结果:人牙囊细胞IL-10表达阳性。25ng/ml IL-10降低人牙囊细胞RANKL的表达,且具有时间依赖性。结论:人牙囊细胞表达IL-10,IL-10通过降低人牙囊细胞RANKL的表达,在牙齿萌出过程中起重要的调控作用。

体外培养人牙囊细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙囊细胞的生物学特性。方法分离18岁人埋伏阻生下颌第三磨牙的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,取不同代数细胞行HE染色观察细胞形态,MTS四唑盐比色法检测细胞增殖活性,茜素红染色定量分析成骨能力。结果第9代细胞面积比第3代、第6代细胞面积显著增大(P<0.05);第3、6、9代细胞增殖活性两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);第3代细胞成骨能力明显强于第6代细胞(P<0.05)。结论随着体外培养代数的增加,人牙囊细胞生物学特征发生明显变化,面积逐渐增大,增殖活性逐渐变缓,成骨分化潜力逐渐减弱。

体外培养观察人牙囊细胞中细胞程序性死亡及其在不同流体静压力下的变化

目的研究体外培养的人牙囊细胞的特征,以及在不同流体静压力作用下细胞程序性死亡(PCD)的改变,探讨PCD在牙齿萌出过程中的作用。方法取12岁男孩埋伏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,将传代的培养细胞应用TUNEL的方法标记PCD细胞,分别在50kPa和100kPa流体静压力作用1h后观察PCD变化,以不加压的人牙囊细胞作为对照。结果体外培养的人牙囊细胞呈梭形、纺锤形或多角形,具有成纤维细胞特征。在50kPa流体静压力下人牙囊细胞PCD阳性细胞率与对照组无统计学差异(P>0.05),而100kPa流体静压力下PCD阳性细胞率较对照组增加了31.65%,有统计学差异(P<0.01)。结论流体静压力可以影响体外培养的人牙囊细胞的程序性死亡。

牙源性干细胞的研究进展

目前已证实,牙周膜、牙髓、根尖乳头和牙囊等牙源性组织中存在间充质干细胞(mesenchy-mal stem cells,MSC),即牙源性干细胞;而且能在一定条件下被成功分离、培养和扩增;并证实其具有多向分化的潜能,且可在体内实现包括牙齿、神经和骨等多种组织的再生。另外,该细胞来源广泛、容易获得,日益成为组织工程学中最具有潜质的间充质干细胞。本文就牙源性干细胞的研究进展及其在组织工程学中的应用等作一综述。

应用Label-free技术研究人牙囊细胞和牙周膜成纤维细胞的差异蛋白质

目的:应用Label-free蛋白定量技术研究牙囊细胞(h DFCs)和牙周膜成纤维细胞(h PDLFs)差异表达蛋白质,为发现h DFCs向h PDLFs转化过程中的重要蛋白质提供参考。方法:应用Label-free蛋白定量技术,结合ultramate 3000 nano-UPLC软件,对h DFCs和h PDLFs总蛋白提取液进行蛋白定性定量检测。然后分别对蛋白质的鉴定结果行重复性、关联性、蛋白相对含量和差异表达蛋白等进行分析;对总体蛋白质和差异表达蛋白质行生物信息学GO或KEGG分析。结果:h DFCs和h PDLFs蛋白相对含量及总体蛋白GO分析结果相似。定量分析显示,当h DFCs分化形成h PDLFs后,有22个差异表达蛋白质,其中下调蛋白15个(P<0.05,FC>2),上调蛋白7个(P<0.05,FC>2)。结论:h DFCs和h PDLFs蛋白质表达谱相似;22个差异表达蛋白质为研究h DFCs向h PDLFs的转化机制提供了方向。

低氧对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的研究低氧对人牙囊细胞(h DFCs)生物学特性的影响。方法利用组织块酶消化法从年轻恒牙中分离培养h DFCs;采用免疫荧光技术检测细胞表面标志物,多向诱导实验检测细胞多向分化潜能;模拟体外低氧微环境,将细胞分为常氧组(20%O2)和低氧组(2%O2),分别对两组细胞行Transwell小室试验检测低氧对细胞迁移的影响,采用CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响。通过实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和Western blot分别从基因和蛋白水平检测h DFCs多能性相关标志物于不同氧体积分数下的表达;分别对两组细胞进行成骨诱导,q RT-PCR检测成骨相关基因,茜素红染色评估矿化结节的形成。结果 h DFCs具有较强的干细胞特征,具有成骨、成脂及成神经多向分化能力,符合间充质干细胞基本标准,能够满足牙组织工程构建对种子细胞的需求。低氧有利于h DFCs多能性的保持,同时促进了h DFCs的迁移和增殖。h DFCs于低氧中进行诱导时,其成骨分化能力得到增强。结论低氧微环境对维持h DFCs多能性,促进h DFCs增殖、迁移和分化有重要作用。

钙离子对人牙囊细胞增殖、迁移和成骨分化的影响

目的:探讨Ca2+对人牙囊细胞增殖、迁移及成骨分化能力的影响。方法:分离、培养人牙囊细胞(human dental follicle cells,hDFCs),免疫荧光染色检测hDFCs来源,茜素红S和油红O染色鉴定多向分化能力;设置不同Ca2+浓度,CCK8法检测1、3、5、7 d时hDFCs的增殖能力;Transwell小室检测24 h时hDFCs的迁移能力;茜素红染色半定量分析法检测钙结节形成;反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测成骨分化相关基因RUNT相关转录因子2(runtrelated transcription factor 2,RUNX2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与对照组相比,3、5、7 d时,3、4、5 mmol/L Ca2+显著促进hDFCs增殖(P<0.05);3、4、5、6 mmol/L Ca2+显著促进hDFCs迁移(P<0.01),高浓度Ca2+对其增殖、迁移无显著影响(P>0.05)。茜素红染色结果表明,Ca2+浓度达4 mmol/L时,可显著促进矿化结节生成(P<0.01),矿化物生成与Ca2+呈浓度依赖性。RT-qPCR结果表明,Ca2+上调成骨分化相关基因RUNX2、OCN的表达(P<0.01)。结论:低浓度Ca2+有利于人牙囊细胞增殖与迁移,而高浓度Ca2+更有利于人牙囊细胞成骨分化。

牙源性干细胞的研究进展

牙源性干细胞(dental stem cells)具有优越的干细胞特性,可以从医疗废弃物(如正畸需要拔除的牙、智齿等)中获得,日益成为组织工程和再生医学研究的干细胞来源,这些干细胞的开发研究将为组织工程和再生医学的研究拓展更为广阔的空间,具有重要的转化研究价值。本文将对几种常见的牙源性干细胞的研究背景、研究现状等进行综述,并对未来应用前景进行展望。

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用。方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变。qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况。结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01)。结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化。

神经营养素3促进人牙囊细胞成骨分化

目的研究神经营养素3(NT-3)对人牙囊细胞(h DFCs)成骨分化的影响。方法体外分离并培养h DFCs,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,CCK-8法检测不同质量浓度NT-3对h DFCs增殖活性的影响,同时检测NT-3对h DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性,以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)m RNA相对表达量的影响,并用茜素红染色法检测矿化情况。结果波形丝蛋白和角蛋白染色结果表明h DFCs为间充质细胞来源。NT-3对h DFCs增殖活性无明显影响;当NT-3质量浓度为25、50、100 ng·m L-1时能明显增强ALP活性,提高BMP-2、OCN m RNA的相对表达量,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),NT-3质量浓度为100 ng·m L-1时BMP-2、OCN m RNA的相对表达量达到最高。当NT-3质量浓度为50、100 ng·m L-1时矿化结节数量最多。结论适宜质量浓度的NT-3能促进h DFCs的成骨分化。