补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用

目的:比较补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用。方法:采用上述4种不同的含药血清对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞株进行处理,通过细胞寿命实验、流式细胞仪、RT-PCR、Western blot方法研究不同中药对衰老细胞周期及其相关基因(P16^(INK4)、Cyclin D1及PCNA)的mRNA转录和蛋白表达的影响。结果:补肾、益气中药对衰老细胞周期有一定的促进作用,并可下调衰老细胞增殖抑制基因P16和周期蛋白Cyclin D1的mRNA/蛋白表达;上调细胞周期促进增殖基因PCNAmRNA/蛋白的表达。而健脾、活血中药对细胞周期及其相关基因和蛋白表达的作用不明显。结论:补肾、益气方药对细胞周期有促进作用,其中的作用可能是通过促进P16途径的基因表达来实现。

在人二倍体细胞上分离和适应的甲型肝炎病毒株

应用人二倍体细胞ＫＭＢ＿（１７）株，从甲型肝炎患者粪便中直接分离到３株甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）。３株ＨＡＶ在ＫＭＢ＿（１７）细胞上已稳定地传代１０次，其抗原滴度可达５１２，感染滴度为７．０～７．７５１ｏｇＴＣＩＤ＿（５０）／ｍ１。用直接免疫荧光法在感染细胞胞浆内检测到特异性荧光着染颗粒，免疫电镜可见成堆２７～３０ｎｍ空心和实心混杂的病毒颗粒，中和试验结果表明抗－ＨＡＶ血清可完全中和这些病毒。证明分离的３株病毒均属ＨＡＶ，可作进一步研究应用。

SIRT3在高糖引起的细胞衰老过程中的表达变化及意义

目的探讨沉默信息调节因子3(SIRT3)在高糖引起的人二倍体成纤维细胞(WI-38)衰老过程中的表达变化和意义。方法通过低糖(3.34mmol/L)、正常糖(5.56mmol/L)、高糖(25mmol/L)三种不同条件培养WI-38细胞,使之由20群体倍增水平(PDs)增至32PDs。采用Western blotting检测p21、p27、Catalase、SIRT3和MnSOD的蛋白表达;免疫荧光共染方法检测各组WI-38细胞中SIRT3和MnSOD和衰老相关核异染色质灶(SAHF)的表达和定位;用荧光探针检测活性氧(ROS)的表达。结果 Western blot-ting结果显示,高糖组SIRT3、Catalase和MnSOD的表达与低糖组及正常糖组比较明显降低(P<0.05);高糖组的p21p、27的蛋白表达与正常糖组比较明显增加(P<0.05);与低糖组比较,高糖组的p21表达上调,而p27表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光共染结果显示,高糖组中的SIRT3、Catalase和MnSOD表达较其他两组明显降低(P<0.05);SIRT3和MnSOD主要存在于胞质中。荧光探针显示,高糖组中的ROS水平与低糖组和正常糖组比较明显增加。结论高糖能加速WI-38细胞的衰老过程,SIRT3可能与高糖引起的细胞衰老有着密切联系。

银杏叶总黄酮延缓细胞衰老的实验研究

目的:研究银杏叶总黄酮(total flavone of Ginkgo biloba,FG)延缓人胚肺二倍体成纤维细胞衰老的作用。方法:采用含FG的大鼠血清对人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞株进行处理,观察2BS细胞寿命;采用荧光实时定量PCR法检测P16基因mRNA的表达。结果:银杏叶总黄酮(FG)能够延长2BS细胞的传代寿命,下调2BS细胞P16基因mRNA的表达。结论:银杏叶总黄酮可通过抑制P16基因表达而延缓细胞衰老。

枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻2BS融合细胞DNA合成的影响

目的 :研究枸杞子、淫羊藿水提液对衰老 -年轻 2BS融合细胞DNA合成的影响。方法 :以人胚肺二倍体成纤维细胞国内标准株 2BS为衰老模型 ,用细胞脱核和细胞融合技术 ,观察枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻 2BS融合细胞的DNA合成的影响。结果 :2BS细胞分别在含 0 0 2 5 (V/V)枸杞子、淫羊藿水提液的DMEM培养液中 ,可连续培养至 6 1 0± 2 9、5 6 0± 2 6代 ,对照组为 4 9 0± 2 6代 (P <0 0 1) ;衰老的 2BS细胞分别用枸杞子、淫羊藿水提液处理 2h后 ,进行细胞脱核并与年轻 2BS细胞融合 ,其〔3H〕TdR掺入百分率明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论 :枸杞子、淫羊藿均能促进衰老 -年轻 2BS融合细胞的DNA的合成速率 ,延长 2BS细胞寿命。

人参皂甙对不同代龄人胚肺成纤维细胞的增殖及Cyclin D1基因表达的影响

目的 :探讨人参皂甙对衰老的人胚肺成纤维细胞增殖及CyclinD1基因表达的调节作用 ,以进一步研究人参皂甙抗细胞衰老的机制。方法 :用体外培养的人胚肺成纤维细胞为细胞衰老模型 ,通过细胞流式分析、免疫组化及RT PCR方法 ,观察了人参皂甙对成纤维细胞的增殖周期、DNA合成 ,CyclinD1mRNA和蛋白质表达情况。结果 :衰老的成纤维细胞用人参皂甙连续处理 4代后 ,处于G1期的细胞数明显减少 ,进入S期的细胞由 16 7%增加到 33% (P <0 0 5 ) ;CyclinD1mR NA表达比对照组下降 ,CyclinD1蛋白质表达由原来的 77 1± 2 9明显下降为 5 2± 6 3(P <0 0 0 1) ,DNA合成增加 17% (P <0 0 5 )。人参皂甙对低代龄细胞的CyclinD1RNA合成有所增加 ,对CyclinD1蛋白质、DNA的作用影响不大。结论 :人参皂甙对人胚肺成纤维细胞具有双向作用 ,对高代龄细胞具有促进细胞增殖 。

^(99)Tc^m-N(NOEt)_2在KMB17人胚肺二倍体细胞与不同种类肺癌细胞中的摄取动力学比较

背景与目的PET/CT显像价格昂贵,因此研究适合SPECT/CT的肿瘤显像剂显得尤为重要。99Tcm-N(NOEt)2[99Tcm-氮-二(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐)]可被肺肿瘤细胞等摄取。本文旨在细胞水平对比研究其在KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞与多种肺癌细胞中的摄取动力学差异,探讨99Tcm-N(NOEt)2显像对肺肿瘤的鉴别诊断价值。方法在等体积且细胞浓度为1×106/mL的YTMLC个旧人肺鳞癌细胞、SPC-A1人肺腺癌细胞、AGZY低转移人肺腺癌细胞、973人高转移肺腺癌细胞、GLC-82个旧人肺腺癌细胞以及KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞的混悬培养液中分别加入等量99Tcm-N(NOEt)2,按300μL精确取样分装于试管中,37oC恒温培养,均分别于5min、15min、30min、45min、60min、75min、90min离心沉淀,测定细胞内放射性计数,计算各时间点各种细胞对99Tcm-N(NOEt)2的摄取百分率。结果6种细胞除SPC-A1细胞与973细胞之间的差异无统计学意义外(LSD-t检验,P=0.838),其余两两之间的差异均有统计学意义(P<0.001);细胞的摄取率大小关系为:973与SPC-A1>YTMLC>GLC-8->AGZY>KMB17;30min-45min时摄取率逐渐趋于平稳,45min摄取率均大于其摄取峰值的96.6%。结论99Tcm-N(NOEt)2显像在肺肿瘤的鉴别诊断中有一定的临床应用价值,且早期显像在30min左右是适合的。

体外长期保存人二倍体成纤维细胞系的初步观察

本文报告HSF 79-2二倍体成纤维细胞系,于体外保持较长时期生长增殖的特性,以及其形成组织样结构的初步结果。HSF79-2细胞系来自17岁女性卵巢癌患者的腹部正常皮肤。原代采用组织块培养法,培养液系McCoy 5 A补加10~25%小牛血清。细胞系以1:2分种率传代、46~54代终止。此系细胞可停止传代,保持原瓶换液而长期生长(观察16个月),并增殖成厚膜。经组织学检查为结缔组织样结构。非传代瓶中保留细胞分别于3,6,12个月后重新传代,细胞的生长特性与二倍体性未变。其总的生存代数与连续传代细胞大致相等。上述特点,可能为二倍体成纤维细胞所共有,可用于保存某些细胞系,为研究细胞的运动、分化提供模型。

喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的影响

目的:通过体外实验,初步研究喙尾琵琶甲乙醇提取物A、B、C对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的抑制作用,并比较3种提取物的抑制效果。方法:用浓度为3.9～1 000.0μg/mL的A、B、C提取物作用于体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测3种喙尾琵琶甲乙醇提取物对细胞增殖的影响。结果:高浓度的3种喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞的生长均有显著的抑制作用,并且呈时间-剂量-效应的依赖关系。在质量浓度为1 000.0μg/mL、72 h时,A、B、C对细胞的抑制率达到最大,分别为49.87%、50.13%、42.34%,A、B、C抑制细胞增殖的活性差异无统计学意义。结论:喙尾琵琶甲乙醇提取物可显著抑制人胚肺二倍体成纤维细胞的增殖,不同浓度乙醇提取物之间对细胞增殖的抑制作用相差不大。

有丝分裂诱导基因6(MIG-6)可诱导人成纤维细胞发生提前衰老

年老细胞许多基因表达发生变化,其中有些基因的表达可以诱导成纤维细胞早衰.癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)是由一些连续癌症基因的信号,以阻止细胞增殖造成的反应.有丝分裂诱导基因6(mitogen-inducible gene-6,MIG-6)是一个抑癌基因,是ErbB RTK通路的负调控因子,抑制肿瘤细胞增殖.本文以人胚肺二倍体成纤维细胞为对象,研究MIG-6蛋白在细胞衰老中的作用.通过Western印迹发现,在老年细胞中MIG-6表达升高.利用逆转录病毒载体将MIG-6基因转入年轻的人胚肺二倍体成纤维细胞中,通过Western印迹方法检测是否过表达MIG-6,然后通过SA-β-gal染色检测其阳性率,发现转染MIG-6基因后的成纤维细胞SA-β-gal染色率明显高于对照组,生长缓慢.实验结果证实,MIG-6蛋白可以诱导人二倍体成纤维细胞提前衰老.

不同pH值对人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5生长的影响

目的在不同pH值培养液中培养人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5),观察其生长情况,选出最有利于MRC-5细胞生长的pH值范围。方法采用细胞培养技术,分别在pH值为6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6的培养液中培养MRC-5细胞,通过显微技术观察细胞形态、对细胞进行计数,然后对MRC-5细胞的生长情况进行分析比较。结果在不同pH值的培养液中,MRC-5细胞的生长状况不同,细胞数量和细胞形态都有差异,当培养液的pH值为7.2-7.3时,细胞生长形态最好,细胞数量最高可达2.37×106/ml。结论研究表明,培养液的pH值为7.2-7.3时,MRC-5细胞的生长状况最佳。

人胚肺二倍体细胞株KMB17在培养过程中的自然凋亡

用延长培养周期方法诱导人二倍体胚肺细胞株ＫＭＢ１７自然凋亡，经光学显微镜、荧光显微镜、细胞流式仪、电子显微镜，证明ＫＭＢ１７细胞出现典型的凋亡特征：细胞圆缩、细胞核浓缩破裂、核染色质凝缩后分布于核膜边缘呈新月状和典型的凋亡峰．研究表明人胚肺二倍体细胞（ＫＭＢ１７）在培养过程中易出现自然凋亡．提示可望通过提高细胞对环境压力的耐受能力，预防或延缓细胞培养过程中的自然凋亡，提高操作单元细胞产品的生产效率．

低功率激光对细胞端粒DNA长度影响的实验研究

本研究目的是探讨低功率氦氖激光对人胚肺二倍体成纤维(2BS)细胞端粒DNA长度的影响。低功率氦氖激光(波长632.8nm,功率2mW可调)对年轻2BS细胞进行照射处理,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞生长和增殖的变化,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)方法检测细胞端粒DNA相对长度。结果表明,激光照射组细胞生长趋势均优于非激光照射组(P<0.05);2BS细胞在年轻时经激光照射后传代至老年时的端粒长度较对照组的老年细胞端粒长度长(P<0.05)。研究结果提示,经适当激光照射后,细胞端粒DNA因衰老而变短的趋势得到减缓。本研究从基因水平为探讨低功率激光延缓细胞衰老的激光生物效应提供实验依据。

低血清培养基培养人胚肺二倍体细胞(2BS株)及其增殖甲型肝炎病毒的初步研究

目的研究2种低血清培养基对人胚肺二倍体细胞(2BS株)的培养效果及甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)在低血清培养基中的增殖情况。方法使用低血清培养基A+2%新生牛血清、B+5%新生牛血清和E-MEM培养基+10%新生牛血清培养细胞,显微镜下观察细胞形态、贴壁情况,细胞计数并绘制生长曲线;优化低血清培养基B的血清浓度;使用5层细胞工厂连续传代培养,放大低血清培养基细胞培养工艺;使用低血清培养基连续进行3次细胞传代后接种HAV,检测病毒滴度。结果使用低血清培养基A+2%新生牛血清、B+5%新生牛血清和E-MEM培养基+10%新生牛血清,细胞生长密度峰值分别为1.55×10^(5)、2.07×10^(5)和1.30×10^(5)个/cm^(2),统计学分析表明,低血清培养基B+5%新生牛血清达到细胞生长密度峰值高于低血清培养基A+2%新生牛血清和E-MEM+10%新生牛血清,差异具有统计学意义(P均<0.05);低血清培养基B+5%新生牛血清同B+3%新生牛血清连续培养3代细胞生长密度差异均无统计学意义(P=0.47、0.07、0.12);使用5层细胞工厂培养细胞,低血清培养基A+2%新生牛血清、B+5%新生牛血清连续培养3代,细胞生长密度均高于E-MEM+10%新生牛血清;低血清培养基B+3%新生牛血清与低血清培养基B+5%新生牛血清的病毒滴度分别为9.50和9.33 lgCCID_(50)/mL,低血清培养基A+2%新生牛血清和E-MEM+10%新生牛血清的病毒滴度分别为8.50和9.00 lgCCID_(50)/mL。结论低血清培养基适用于培养2BS细胞增殖HAV,为低血清培养基在甲肝疫苗生产中的应用奠定了基础。