Influence of Follicular Fluid on <i>in Vitro</i>Maturation and Fertilization of Bovine Oocytes

The aim of this study was to investigate the effect of time on in vitro maturation of bovine oocytes and of the addition of follicular fluid on meiotic progression. The cumulus-oocyte complexes (COCs) collected from 3 to 6 mm follicles were obtained from ovaries of slaughtered female animals. The medium of maturation was supplemented or not with 20 μL follicular fluid (FF);661 oocytes were matured in vitro (extrusion of the first polar corpuscle) for 22 hours with added follicular fluid (AFF) (72.01%) or without follicular fluid (WFF) (67.53%) and 679 oocytes were matured in vitro for 26 hours (extrusion of the first polar corpuscle) with AFF (92.1%) and WFF (77.15%). The results of extrusion of the second polar corpuscle as an event related to the fertilization percentages showed that the increase in the fertilization rate is maintained at 26 hours with AFF (79.45%), but the percentage decreases WFF (65.08%). After 22 hours, the fertilization rate was 62.38% AFF and 53.40% WFF. The developmental competence of bovine oocytes is affected by the duration of maturation in vitro and the inclusion in the FF culture medium. The use of follicular fluid in the in vitro maturation medium may be a biological strategy to increase the cumulus expansion, the nuclear maturation and the in vitro fertilization.

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究猪卵泡液(pFF)的浓度和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响.结果表明,在猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外成熟培养46～48 h中的后23～24 h去除促性腺激素可有利于卵丘细胞的扩散,但对卵细胞的核成熟无显著影响(P>0.05);添加适量(10%)的pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度太高则相对抑制卵子核成熟进程.

成熟培养基中添加卵泡液对牛体外受精卵发育的影响

从牛屠体卵巢采得卵母细胞后,置于CO_2培养箱中作24小时成熟培养。在成熟培养液中分别添加0％、10％、20％、30％牛新鲜卵泡液(BFF)或灭活卵泡液(hBFF)。用分层Percoll液将解冻精子离心洗涤后,悬浮于含有10μg/ml肝素的修正Tyrode液滴中,将培养成熟的卵子移入后作授精培养。20小时后,固定、染色一部分卵子,镜检其受精情况,其余卵子移入发生培养基与颗粒膜细胞作混合培养。试验结果表明,新鲜卵泡液添加组与对照组比较,在受精率、多精子侵入率以及受精后的早期卵裂率方面均无显著差异。在囊胚发生率方面,30％添加组(29.8％)显著高于对照组(13.5％)(P<0.05);极显著地高于10％添加组(11.5％)(P<0.01)。但是,在成熟培养基内添加灭活卵泡液后,各组间均无显著差异。因此,对牛卵母细胞作成熟培养时,添加适量新鲜卵泡液,可以提高受精后的发育潜能,提高囊胚的发生率。

两种未成熟卵母细胞体外成熟培养液的运用效果比较

目的:通过比较自行研配的培养液与商品化培养液在卵母细胞体外成熟中的运用效果,为进一步优化体外成熟培养体系提供依据。方法:分别选择使用自行配制培养液的(IVM-A组)110个周期和使用商品化(IVM-B组)培养液的99个周期,并以同期行ICSI的治疗周期为对照(ICSI-C1和ICSI-C2),比较两组在体外成熟、胚胎发育、胚胎种植、临床妊娠及结局等方面的差异。结果:在两对照ICSI-C1和ICSI-C2各项指标无差异的情况下,IVM-A组体外成熟和胚胎发育等方面均高于IVM-B组,且可移植胚胎率、优质胚胎率明显提高(P<0.05或P<0.01),可移植胚胎率已达到ICSI组水平。虽然表面上IVM-A组在胚胎种植率、妊娠率(临床妊娠率)、活产率等指标低于IVM-B组,但不同阶段的对照组其指标明显改变,ICSI-C2(2006年以后)明显好于ICSI-C1。这种差异可能与近年来的临床治疗方案的改善及宫腔镜的使用有关。值得注意的是,IVM-A的流产率只有10.53%,显著低于其他3组,而同期的对照(ICSI-C1)却明显高于ICSI-C2,提示使用自行配制培养液培养的胚胎可显著降低流产的发生。但由于样本量还不够大,结果尚待进一步验证。结论:自行配制的培养液具有较好的运用效果,可能与其中额外添加的mHFF及E2等有关。但系统尚需进一步优化,以保证其高效、安全、价廉。

体外受精-胚胎移植周期未成熟卵体外成熟培养的临床价值

目的探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期未成熟卵体外成熟培养(IVM)的临床价值。方法对106例不孕患者IVF/ICSI-ET治疗周期中357枚未成熟卵(MⅠ期,217枚;GV期,140枚)进行24h和48h体外培养,比较不同发育阶段未成熟卵的体外成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率及囊胚形成率。结果 MⅠ期卵24h和48h总成熟率均显著高于GV期卵(分别为59.91%vs.24.29%和72.35%vs.42.86%)(P<0.05);体外成熟MⅡ卵平均每取卵周期可利用胚胎数只有(0.50±0.84)枚,且受精率、卵裂率和优胚率、可利用胚胎数均显著低于同一促排卵周期体内成熟MⅡ卵(P<0.05)。结论 IVF-ET周期中所获未成熟卵经IVM能发育成熟,并具备一定的受精和胚胎发育潜能,但相关指标明显低于体内成熟卵,临床应用价值有限。

人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

为了探讨人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响,将穿刺获得的牛卵母细胞随机分为试验组和对照组,试验组以人颗粒细胞作为滋养层与牛卵母细胞在体外成熟液中共培养,对照组仅使用与试验组相同的体外成熟液培养,观察并比较两组的极体排出率、孤雌激活囊胚形成率。结果发现,试验组的极体排出率(72.35%)显著高于对照组的极体排出率(52.86%)(P<0.01);经过孤雌激活后,试验组的囊胚形成率为12.82%,对照组为4.76%,两组之间无显著性差异(P>0.05)。说明人颗粒细胞可以作为牛卵母细胞体外成熟时的滋养层,两者共培养可以提高牛卵母细胞体外培养的核成熟率。

处理方式不同的颗粒细胞和卵泡液对牛卵母细胞体外受精后卵裂率和囊胚率的影响

将牛的卵母细胞置于添加有不同预处理颗粒细胞及含有卵泡液的培养液或不含有卵泡液的培养液中进行体外成熟、受精及胚胎发育培养, 研究了颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对牛卵母细胞成熟、受精后卵裂率、囊胚率的影响。 2178 枚卵母细胞体外成熟受精后胚胎发育的对比观察结果表明: 颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对卵母细胞成熟受精后胚胎的卵裂具有显著影响 (P<0.05); 颗粒细胞对囊胚的发育有显著影响 (P<0.05); 卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对囊胚的发育无显著影响 (P>0.05)。不同因素对卵裂率、囊胚率的影响表现为: 颗粒细胞因素﹥培养液因素﹥培养液×颗粒细胞交互作用。结论: TCM199 培养液中添加卵泡液和单层颗粒细胞组成的培养系统用于牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的效果较好。共培养体系中的单层颗粒细胞用经酶消化分散处理后在培养箱中孵育 10min 的颗粒细胞替代时, 胚胎的发育效果并不受影响。

猪卵泡液与猪卵母细胞体外成熟与凋亡的关系

本研究就猪卵泡液对猪卵母细胞的体外成熟及凋亡进行了探索 :试验一证明 ,体外培养 46—48h,成熟液添加 5 %猪卵泡液能促进成熟 ,核成熟率为 41 .2 % ,成熟液添加 2 0 %猪卵泡液则抑制成熟 ,核成熟率为 2 3 .1 % ,二者差异显著 ;试验二证明 ,添加猪卵泡液可以促进猪卵母细胞体外存活时间的延长 ,体外培养第 1 6天 ,含 0 %、5 %、1 0猪卵泡液的存活率分别为 2 .6 %、2 2 .2 %、1 8.6 % ,添加与否差异显著。

pFF对猪卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

探讨了两种不同成分成熟液配方(I:含PMSG、hCG、pFF与II:含FSH、LH)对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活发育能力的影响。结果表明:当卵母细胞分别在I和II液中成熟培养42 h后,卵母细胞存活率差异不显著(82.66%∶83.5%)(P>0.05)。对成熟卵母细胞孤雌激活后体外培养结果表明:I成熟培养组的卵母细胞卵裂率低于II成熟培养组(69.44%∶78.38%)(P<0.05)。但两组卵母细胞经144 h培养后囊胚发育率差异不显著(35.0%∶32.04%,P>0.05)。由此可知:采用不含pFF、化学成分已知的成熟液可以满足猪卵母细胞体外成熟和卵母细胞孤雌激活后的正常发育。

人卵体外受精与卵泡液中促性腺激素、催乳素、雌二醇、孕酮、睾酮的关系

采用放射免疫法对21例行人卵体外受精的23个卵泡的卵泡液进行激素测定。结果发现FSH、LH、E_2在中间型与成熟型卵母细胞的卵泡液中含量明显高于闭锁型与缺卵母细胞的卵泡液中的含量(P<0.05),且与受精有明显关系。P在各型中变化不大。PRL的含量在成熟型较高,T在中间型稍低,三者与受精无明显关系。

绵羊体外受精技术条件优化的研究

探讨了卵泡液、受精时间和季节对绵羊卵母细胞体外培养效果的影响。从屠宰场采集羊卵巢,抽取卵巢表面2mm^6mm的卵泡卵母细胞,进行体外成熟培养;卵母细胞成熟后,与处理后的精子共同培养进行受精。结果表明,在卵母细胞成熟培养液中添加绵羊卵泡液(SFF)组的卵裂率和囊胚发育率均优于添加同等浓度的牛卵泡液(BFF)组;受精22、18、12h组的卵裂率分别为64.85%、54.39%、48.72%,受精22h和18h组间差异显著(P<0.05),受精22h组和12h组间差异极显著(P<0.01)。秋季绵羊体外受精的卵裂率和囊胚率均高于夏季,差异显著(P<0.05),但秋季与春季相比差异不显著(P>0.05)。因此,进行绵羊卵母细胞体外成熟培养时,培养液中添加SFF;受精时,精卵共培养时间为22h的效果较好。在绵羊的繁殖季节秋季进行体外受精较春季和夏季的结果好。

人卵泡液对牛未成熟卵母细胞体外培养的影响

【目的】探讨以人成熟卵泡液作为体外成熟培养液培养牛卵母细胞的可能性。【方法】观察并比较未成熟牛卵母细胞分别在灭活人卵泡液与成熟培养液、灭活与未灭活人卵泡液、未灭活人卵泡液不同培养温度（38,38.5和39℃）下,进行体外成熟培养时卵母细胞的极体排出率。【结果】在灭活人卵泡液与成熟培养液中,牛卵母细胞成熟率分别为58.5%和63.5%,二者无显著性差异（P〉0.05）;在未灭活人卵泡液中,牛卵母细胞成熟率（58.8%）显著高于灭活人卵泡液（37.5%）（P〈0.01）;在未灭活人卵泡液中38,38.5和39℃培养的牛卵母细胞的成熟率分别为60.7%,58.1%和54.1%,三组间差异不显著（P〉0.05）。【结论】人卵泡液可以用于未成熟牛卵母细胞体外成熟;人卵泡液用作成熟培养液时无需灭活,培养温度为38-39℃。

人尿促性腺激素、雌二醇及表皮生长因子对牛卵母细胞体外成熟质量的影响

试验旨在研究不同激素配比及表皮生长因子(EGF)浓度对牛卵母细胞体外成熟及卵母细胞质量的影响。将随机分组的卵丘-卵母细胞复合体于添加FSH+LH、HMG、FSH+LH+E2、HMG+E24种不同激素组合配比的成熟基础液中培养,对比其体外成熟率,比较了EGF对牛卵母细胞体外成熟率和孤雌胚胎体外发育的影响,并采用TUNEL法检测添加不同浓度EGF的牛孤雌激活囊胚细胞凋亡情况。结果表明,添加HMG的成熟试验结果稳定,E2对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E2联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,在成熟液中添加30ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。因此,在体外成熟培养液中添加0.075IU/mL HMG、1μg/mL E2和30ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟和质量较为有益。

催乳素和牛卵泡液对胚胎体外成熟及未成熟的牛卵母细胞的影响(英文)

对催乳素和牛卵泡液在水牛卵母细胞体外成熟中的作用进行了探讨.来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在含体积分数为5%CO2的培养箱中培养24～26h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力.实验1在成熟液中添加1 0μg/mL催乳素(PRL),卵母细胞的囊胚发育比例(12 8%)比对照组(9 1%)高但不显著.实验2添加5%牛卵泡液(BFF),卵母细胞卵裂的比例明显高于对照组,但囊胚形成率则几乎一样;添加1 0μg/mLPRL和5%BFF组卵母细胞卵裂的比例为38 1%,而发育成囊胚阶段的卵母细胞的比例为14%.试验结果表明:添加适宜浓度的BFF和PRL能促进未成熟的水牛卵母细胞体外成熟后的胚胎发育能力.

人未成熟卵母细胞体外培养成熟、受精及胚胎移植

目的 应用卵母细胞体外成熟 (IVM)技术帮助卵泡成熟障碍的不孕症患者获得妊娠及分娩。方法 接受未成熟卵IVM技术治疗者 30例 35个周期 ,其中多囊卵巢综合征 14例 ,有卵巢过度刺激综合征病史 6例 ,体外受精和胚胎移植 (IVF ET)周期中卵巢反应不良患者 10例。设计卵巢刺激方案 ,采用含人成熟卵泡液的IVM培养液 ,建立未成熟卵母细胞的体外培养方法。结果 35个周期共取得未成熟卵母细胞 2 0 3个 ,平均每个周期 5 8个。培养后有 15 6个卵母细胞排出第一极体 ,IVM率 76 8% (15 6 2 0 3) ;在卵胞浆单精子显微注射 (ICSI) 12～ 18h后观察原核 ,正常受精率为 76 9%(12 0 15 6 ) ;共有移植周期 33个 ,获 8例临床妊娠 ,妊娠率 2 4 % (8 33) ;有 5例共 7个婴儿出生。结论 IVM对一些卵泡发育和成熟障碍 ,特别是顽固性多囊卵巢综合征患者 ,是一种有效的辅助生育措施。人成熟卵泡液含有理想的自然促卵母细胞成熟的成分。

牛卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了牛卵泡液（ＢＦＦ）对牛卵母细胞体外成熟的影响。在成熟培养液中添加１０％的ＢＦＦ，明显提高牛卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率（４５．１％比２８．２％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞体外成熟后的受精分裂率无明显影响（８７．５％比８７．５％）。然而，当ＢＦＦ在成熟培养液中的浓度提高到４０％时，卵母细胞体外成熟后的受精分裂率（６８．６％）和囊胚发育率（１６．６％）均明显下降（Ｐ＜０．０５）。来自不同大小卵泡（２～５ｍｍ，５．１～８ｍｍ和大于８ｍｍ）ＢＦＦ的卵母细胞体外成熟培养效果无明显差异，只是来自大于８ｍｍ卵泡的ＢＦＦ将卵母细胞粘在一起，明显地降低成熟培养后的可用卵母细胞数。在成熟培养液中加入激素（２．５×１０３ｉｕ／Ｌ促性腺激素（ＨＣＧ），５０ｉｕ／Ｌ促乳素，０．０５ｍｇ／Ｌ胰岛素、睾酮和雌二醇）对ＢＦＦ的卵母细胞成熟培养效果无影响。这些结果表明，在成熟培养液中添加一定浓度的ＢＦＦ可促进牛卵母细胞获得胚胎发育能力，ＢＦＦ的这一作用与其来源的卵泡大小和激素的存在与否无关。

添加两种不同培养成分对人未成熟卵体外成熟培养的影响

目的:研究添加两种不同培养成分对人未成熟卵母细胞体外成熟培养(IVM)的效果。方法:选择接受ICSI治疗的77名不孕患者共收集未成熟卵177枚,随机分A组(激素组)33例,添加0.075 IU/ml FSH及0.075 IU/ml LH至基础IVM培养液中;B组(成熟卵泡液组)44例,50%基础IVM培养液与50%人成熟卵泡液配成。将两组收集的未成熟卵母细胞放入不同培养液中培养48 h,每24 h倒置显微镜下观察卵母细胞的形态;对MII卵进行ICSI,ICSI操作后继续培养,ICSI后16～20 h进行受精观察,24及48 h分别进行卵裂观察及胚胎评分。结果:①B组未成熟卵母细胞48 h成熟率和MI期卵母细胞48 h成熟率显著高于A组,差异有统计学意义(P<0.05),两组培养液GV期卵母细胞24和48 h成熟率比较差异无统计学意义(P>0.05)。②B组2PN卵裂率显著高于A组,差异有统计学意义(P<0.05),两组2PN受精率及可利用胚胎率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:人成熟卵泡液内可能含有一些未知的有利于卵母细胞成熟的因子,深入研究卵泡液的成分,进一步明确其促卵母细胞成熟机制对开发新的IVM培养液、改善IVM的临床结局有重要意义。

人脐带血清用于人未成熟卵母细胞体外成熟培养并获得妊娠的观察

目的:以人脐带血清作为卵母细胞体外成熟培养(IVM)培养液的主要成份开展IVM技术研究,旨在为IVM临床妊娠率的提高,IVM技术的进步探索一条新路。方法:47例、47个周期的PCOS患者接受了IVM技术的治疗。未成熟卵母细胞分别入IVM培养液Ⅰ(含人成熟卵泡液,卵泡液组)和IVM培养液Ⅱ(含脐带血清,脐带血清组)行体外成熟培养,分析人脐带血清对IVM结果影响。结果:脐带血组:15周期,160枚未成熟卵母细胞,体外成熟过程中,成熟率、优质胚率及临床妊娠率分别为93.75%(150/160)、50.00%(60/120)和40.00%(6/15),已分娩4例,另2例处于妊娠阶段;卵泡液组:32周期,未成熟卵母细胞349枚,成熟率、优质胚率分别为77.08%(269/349)和23.77%(53/223),胚胎移植31周期,获得7例临床妊娠,妊娠率为22.58%(7/31),目前已分娩4例,3例流产。成熟率和优质胚率方面,脐带血组高于卵泡液组。结论:人脐带血清作为IVM液的主要成份相对于人成熟卵泡液,将更加有助于未成熟卵母细胞的体外成熟培养、改善胚胎质量,并获得较好的妊娠结局。

牛卵泡卵体外成熟及其受精能力的研究

本试验主要研究了牛卵泡卵体外成熟、体外受精及其受精过程的发生。从屠宰场收集800枚牛卵泡卵进行体外成熟培养,并用体外获能的精子体外受精。在用m-TCM199培养21、22、24、26、28h后,达到中期Ⅱ的卵母细胞比例分别为33.89％、74.16％、77.78％、86.67％、85.71％;25h后,如果继续培养,成熟的卵母细胞比例不再显著增加。卵母细胞的自身形态显著地影响其成熟效果,A、B、C级卵培养24h后分别有94.60％、55.43％、31.25％的卵母细胞达到中期Ⅱ。卵泡卵在体外滞留8h后,其成熟率(47.11％)明显地低于45min(77.92％)或4h(74.60％)。肝素和钙离子载体A 23187都能诱发牛精子获能,二者在受精效报上差异不显著(P>0.05),并且都有多精入卵现象发生。授精后6h精子进入卵内,精子入卵后2～3h头部膨大,6h后出现早期原核,最早发生卵裂是在授精后30h。