三种IL-15基因转染NCI-H446细胞模型的建立与鉴定

目的构建并鉴定三种IL-15基因转染的人小细胞肺癌(NCI-H446)细胞模型。方法PCR法扩增得原型IL-15基因片段(FhIL-15)I、L-15成熟肽基因片段(FhIL-15mp)和IL-2信号肽基因片段(FhIL-2sp);利用重叠延伸基因拼接法将FhIL-15mp和FhIL-2sp拼接成改型IL-15基因片段(FhIL-2sp-hIL-15mp)。将三种IL-15基因片段(FhIL-15、FhIL-15mp和FhIL-2sp-hIL-15mp)分别插入真核表达载体pEGFP-N1构建成相应的重组质粒(PhIL-15、PhIL-15mp和PhIL-2sp-hIL-15mp),用脂质体法分别转染NCI-H446、G418筛选得三种IL-15基因转染的NCI-H446细胞(C-hIL-15、C-hIL-15mp、C-hIL-2sp-hIL-15mp)。对所得的各基因片段和重组质粒,用琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定;对所得的各转染细胞,用RT-PCR法检测hIL-15mRNA的表达,ELISA法检测hIL-15蛋白的分泌。结果琼脂糖凝胶电泳和测序证明,FhIL-15、FhIL-15mp、FhIL-2sp-hIL-15mp电泳条带位置和基因序列正确。三种转染细胞均有IL-15mRNA表达,但仅C-hIL-2sp-hIL-15mp可测到22pg/mL的IL-15蛋白分泌。初步应用表明,三种转染细胞确有不同的免疫生物学特性。结论正确构建了三种IL-15基因转染的NCI-H446细胞模型,可在进一步研究IL-15基因与肿瘤细胞免疫生物学特性的关系及至机制中应用。

rhIL-15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 获得rhIL 15基因工程菌。方法 从肺癌细胞株A549中提取细胞总RNA ,用RT PCR法扩增编码人IL 15成熟区基因的片段。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,插入融合表达质粒pGEX 4T 2的相应酶切位点 ,构建重组融合蛋白表达质粒 ,并转化感受态大肠杆菌BL2 1而得到工程菌。结果 重组质粒插入片段核酸序列测定的结果 ,与文献报道的IL 15蛋白成熟区的核酸序列相一致。该工程菌所表达的融合蛋白多数以包涵体的形式存在 ,占菌体蛋白总量的 39%。复性后 ,纯化的rhIL 15蛋白经MTT比色法初步测定 ,具有促进CTLL 2细胞增殖的能力。结论 获得了具有生物学活性的rhIL

重组人白细胞介素15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 :获得重组人白细胞介素 1 5 (rhIL 1 5 )高效表达菌株。方法 :经细菌脂多糖 +γ干扰素活化的人外周血单个核细胞提取细胞总RNA ,用RT PCR方法扩增出编码人IL 1 5cDNA的基因片段 ,采用 pBV2 2 0表达载体 ,经DNA重组技术构建IL 1 5基因工程菌。结果 :核酸序列测定与预期一致 ,所表达的IL 1 5经SDS PAGE证明分子量约 1 5kD ,表达量占菌体总蛋白的 2 8% ,经CTLl2 细胞检测 ,表达产物粗提物 1∶1 0 0复性后效价可达到1 0 6IU /ml。结论 :构建的基因工程菌为IL 1 5高效表达菌株。

IL-15 cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的建立转人白细胞介素-15(hIL-15)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-15的表达情况。方法将携带人白细胞介素-15的质粒pcDNA3.1(+)-hIL-15转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Westernblot和ELISA法对hIL-15的表达进行检测。结果IL-15基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达。RT-PCR电泳结果显示hIL-15基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-15的含量为(185.0±12.2)pg/ml,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-15。结论hIL-15基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达。

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体，以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ，并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接，构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析，证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。

IL-15表达质粒联合HPV基因疫苗诱导细胞免疫应答的实验研究

目的研究白细胞介素15(IL-15)真核表达质粒,对人乳头瘤病毒(HPV)16E7基因疫苗所诱导的小鼠特异性细胞免疫应答的影响。方法构建含IL-15的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-15。将该质粒与HPV16 E7基因疫苗通过肌肉注射方式免疫雌性BALB/c小鼠。基因免疫后测定其血清γ-干扰素(IFN-γ)水平;并制备脾淋巴细胞悬液,经体外E7蛋白再刺激后用MTT法检测其T淋巴细胞增殖情况。结果pcDNA3.1-IL-15与pcD-NA3.1-E7共同注射,可以提高免疫小鼠血清中IFN-γ水平至414.1pg/ml,与E7+空质粒组、E7组比较差异有统计学意义(P<0.01)。pcDNA3-1-IL-15与pcDNA3.1-E7共同注射,可以增强特异性T细胞增殖反应,OD570差值为1.313,与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论IL-15真核表达质粒可以提高HPV16 E7基因疫苗的免疫原性,增强小鼠细胞免疫应答。

人IL-15基因在CHO细胞中的表达及其对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

目的在CHO细胞中进行人白细胞介素-15基因真核表达载体的稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-15对鼻咽癌细胞体外增殖的抑制作用。方法将真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIL-15转染CHO细胞,G418筛选稳定表达株;采用RT-PCR和ELISA法对hIL-15的表达进行检测,MTT法检测rhIL-15对人鼻咽癌细胞系CNE-2Z体外增殖的抑制效应。结果人IL-15在CHO细胞中获得稳定表达,RT-PCR显示细胞的rhIL-15mRNA呈现高水平,ELISA检测到rhIL-15在细胞中的分泌性表达,浓度达(3.08±0.23)μg/ml,且所表达的人IL-15具有较强的抑制CNE-2Z鼻咽癌细胞增殖的作用。结论成功地在CHO细胞中获得了hIL-15蛋白的高效、稳定表达,重组表达蛋白rhIL-15体外能有效地抑制鼻咽癌细胞增殖,为进一步研究人IL-15抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。

新型重组毒素hIL15M/TNFαM的构建、表达与活性测定

目的 构建、表达hIL15M TNFαM融合毒素 ,为研制可消除hIL15受体高表达细胞的特异性导向药物奠定基础。方法 人白介素 15突变体 (hIL15M)对靶细胞不具有激动作用 ,将该突变体与TNFα突变体 (TNFαM)编码基因直接融合克隆至pET表达载体 ,并纯化出融合蛋白hIL15M TNFαM ,MTT法测定该蛋白的细胞毒活性。结果 SDS PAGE分析表明 ,重组菌株诱导后可以表达出 3 0× 10 3与预期大小一致的特异蛋白带。纯化的hIL15M TNFαM对PHA激活的T细胞的杀伤作用是静止性T细胞的 13倍。结论 hIL15M TNFαM融合蛋白对高表达hIL15受体的细胞具有较强的杀伤性作用 ,提示其对由活化的异常T细胞增多所致的疾病具有潜在的治疗作用。

人IL-15cDNA真核表达载体的构建及其在BEL-7402细胞中的表达

目的 :构建人白细胞介素 - 15 (hIL - 15 )真核表达载体并在肝癌细胞BEL - 74 0 2中表达 ,为进一步研究IL - 15的功能及临床应用奠定基础。方法 :采用RT -PCR方法自正常成人外周血单核细胞中扩增出hIL -15cDNA ,将其克隆至T -vector中 ,经测序确证后 ,将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1hisB中 ,脂质体法转染BEL - 74 0 2细胞进行表达 ,鉴定表达产物的生物学活性。结果 :测序结果与已报道hIL - 15cDNA序列一致。脂质体转染后获得 6个BEL - 74 0 2细胞阳性克隆 ,IL - 15活性测定为 15 6～ 2 5 2u/ml。结论 :成功地构建了真核表达载体 pcDNA3.1hisB -IL - 15 ,IL - 15cDNA转导的人BEL - 74 0 2肝癌细胞可表达有生物活性的IL - 15。

新型融合蛋白hIL15M-TNFαM表达质粒的构建

目的 构建hIL15M -TNFαM融合毒素的表达质粒 ,为该融合毒素的功能研究及临床应用前景的分析评价奠定基础。方法 通过PCR删除hIL15 5′端前 8个氨基酸残基的编码序列获得人白介素 15突变体 (hIL15M ) ,将hIL15M基因片段与人工改造的TNFα基因按正确的阅读框架融合 ,定向克隆于表达载体pET16b。结果 经酶切分析 ,所构建的质粒均插入hIL15M -TNFαM融合基因。结论 利用 pET16b表达载体成功构建融合毒素hIL15M

基于piggyBac转座子系统构建长期表达人细胞因子的免疫缺陷小鼠模型

目的:探讨表达人白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素15 (IL-15)、干细胞生长因子(SCF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的piggyBac (PB)转座子系统在免疫缺陷小鼠体内的长效表达情况,为改善人源化小鼠模型中人免疫细胞的重建提供简单长效的新方法。方法:构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的PB转座子质粒(PB-GFP),构建含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子质粒(PB-5F)。293T细胞分为阴性对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pLVTHM质粒)、瞬时转染组(转染PB-GFP质粒)和稳定转染组[共同转染PB-GFP和转座酶质粒(super-PB)]。转染后每3d,采用流式细胞术检测各组细胞中GFP阳性(GFP+)细胞百分率。将NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NCG)小鼠分为瞬时转染组和稳定转染组,瞬时转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,稳定转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒和super-PB质粒。小鼠尾静脉高压注射后1、3、5和9d及随后每周1次采血分离血清,ELISA法检测各组NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。结果:PB-GFP转染293T细胞30d后,稳定转染组GFP+细胞百分率(4.61%±0.42%)明显高于阳性对照组(0.58%±0.05%)和瞬时转染组(0.86%±0.10%)(P<0.05)。NCG小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,注射后第30天,稳定转染组小鼠血清中IL-6、IL-15和GM-CSF水平均高于瞬时转染组(P=0.048,P=0.051,P=0.045);注射后第60天,稳定转染组小鼠血清中仍能检测到IL-6、IL-15和GM-CSF。结论:体外验证了PB转座子系统的长效表达,成功构建了具有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子载体的质粒,建立了长效稳定表达人IL-6、IL-15和GM-CSF的免疫缺陷小鼠模型。

IL-15表达质粒联合HPV基因疫苗诱导特异性淋巴细胞增殖的实验研究

目的探讨IL-15真核表达质粒对HPV16E7基因疫苗所诱导的小鼠特异性淋巴细胞增殖的影响。方法利用基因重组技术构建含IL-15的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-15。将该质粒与HPV16E7基因疫苗通过肌肉注射方式免疫雌性BALB/c小鼠。基因免疫后,制备脾淋巴细胞悬液,在体外经E7蛋白再刺激后用MTT法检测其T淋巴细胞增殖情况。流式细胞仪检测脾淋巴细胞亚群。结果pcDNA3.1-IL-15与pcDNA3.1-E7共同注射,可以增强特异性T细胞增殖反应,A570差值为1.313,与对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。实验组脾CD4+淋巴细胞数量和CD4+/CD8+比值均高于对照组(P<0.05)。结论IL-15真核表达质粒可以提高HPV16E7基因疫苗免疫原性。IL-15基因是一种优良的HPV16E7基因疫苗的基因佐剂。

外源性IL-15/IL-10受体阻断剂对HIV-1感染者T细胞体外增殖的影响

目的探讨白介素10(IL-10)受体阻断剂(Anti-IL-10R)或/和外源性IL-15(单独或联合)对HIV-1感染者T淋巴细胞增殖的影响。方法纳入50例HIV-1感染者作为研究对象,接受抗病毒治疗组(HAART组)及未接受抗病毒治疗组(HAART-na?ve组)病例分别为27例及23例。以HIV-1 P24编码区的氨基酸序列人工合成的13个肽段组成的肽段库作为特异性抗原刺激表位,采用羧乙基锗倍半氧化物(CFSE)对外周血单个核细胞(PBMC)示踪染色,在Anti-IL-10R及外源性IL-15(单独或联合)存在条件下,与PBMC共培养,流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖情况。结果 HAART组及HAART-na?ve组,Anti-IL-10R、IL-15、Anti-IL-10R/IL-15刺激孔的CD4^+及CD8^+T的中位增殖倍数分别与对照孔比较,CD4^+T细胞的结果分别为:0.98(P=0.45),1.06(P=0.18);1.24(P=0.006),1.27(P=0.06);1.05(P=0.314),1.08(0.003),CD8^+T细胞增殖倍数分别为:0.94(P=0.45),1.17(P=0.177);1.96(P=0.000),1.37(P=0.000);1.49(P=0.000),1.34(P=0.000)。在HAART组中,CD4^+T细胞增殖与Anti-IL-10R相关(r_s=0.195,P=0.021),CD8^+T细胞增殖与IL-15相关(r_s=0.717,P<0.0001)。在HAART-na?ve组中,CD4^+及CD8^+T细胞增殖均与IL-15相关(r_s=0.341,P=0.003;r_s=0.876,P<0.0001)。无论HAART组还是HAART-na?ve组,CD4^+T细胞和CD8^+T细胞增殖与CD4、CD8、Th/Ts及HIV-1病毒载量均无明显相关性。结论外源性IL-15能促进HIV-1感染者T淋巴细胞体外增殖,并且经HAART治疗后这一作用似乎更强;IL-10R阻断剂可能对HIV-1感染者的CD4^+T淋巴细胞有潜在的体外促活化及增殖作用。

外源性IL-15、IL-21对HIV-1感染者T淋巴细胞增殖的影响

目的探讨外源性细胞因子IL-15、IL-21对HIV-1感染者T淋巴细胞增殖的影响。方法研究对象为24例已接受高效抗逆转录病毒治疗(HAART)及25例未经HAART的HIV-1感染者(HAART组及HAART-nave组)。以HIV-1P24编码区的氨基酸序列人工合成的12个肽段组成的肽段库作为特异性抗原表位,另添加外源性细胞因子IL-15或者IL-21,对两组研究对象的外周血单个核细胞(PBMC)进行体外刺激培养,采用羧乙基锗倍半氧化物(CFSE)对PBMC进行示踪染色;流式细胞仪检测刺激后的淋巴细胞的增殖情况。结果 HAART-nave组和HAART组中CD4+及CD8+T细胞的增殖百分率,两组的组内比较可见,IL-21刺激的实验组(IL-21组)和IL-15刺激的实验组(IL-15组)均显著高于相应对照组(P均为0.000);HAART组CD8+T细胞增殖水平,IL-15组及IL-21组均明显高于HAART-nave组(Z=-2.394,P=0.017;Z=-2.130,P=0.033);HAART组与HAART-nave组中实验分组IL-15组及IL-21组CD4+细胞增殖情况比较差异均无统计学意义。结论外源性IL-15、IL-21均能促进HIV-1感染者HARRT治疗前及治疗后CD4+及CD8+T淋巴细胞的增殖;且两种因子对CD8+T淋巴细胞增殖的作用HAART治疗后大于HAART治疗前。

慢性肝功能衰竭患者血清白细胞介素-10、-13、-15水平变化和医院感染的相关性

目的探讨血清IL-10、IL-13、IL-15水平在慢性肝功能衰竭患者中的变化和在医院感染发生、发展中的意义。方法采用双抗体夹心ELISA法检测58例慢性肝功能衰竭患者入院时及入院2周时血清IL-10、IL-13、IL-15水平。结果入院时IL-15值及IL-15/IL-10、IL-15/IL-13比值比较,慢性肝功能衰竭组明显高于健康对照组[(358.16±290.91)ng/L比(38.55±21.49)ng/L、12.93±14.26比1.10±0.55、98.55±97.55比9.70±5.03,均P=0.000],死亡组明显高于治疗好转组[(479.93±205.52)ng/L比(244.51±236.29)ng/L、17.65±17.78比8.53±7.98、130.69±115.50比68.55±65.99,均P<0.05)。入院2周时医院感染组IL-10、IL-13、IL-15值明显高于无医院感染组[(383.49±147.04)ng/L比(75.19±85.68)ng/L、(47.75±20.96)ng/L比(14.47±17.66)ng/L、(582.61±334.09)ng/L比(322.17±239.49)ng/L,P<0.01],未发生医院感染者及好转组血清IL-10、IL-13值明显高于死亡组[(104.34±104.24)ng/L比(39.18±29.98)ng/L、(20.14±21.61) ng/L比(7.46±6.56)ng/L,P<0.05)。入院2周与入院时IL配对比较,医院感染组中好转组IL-10、IL-13明显高于入院时(P<0.01)。结论慢性肝功能衰竭患者存在异常的细胞免疫应答,合并医院感染后可能进一步激活辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2,加重免疫功能紊乱。联合检测血清IL-10、IL-13、IL-15值有助于预后判断和指导治疗,并可能作为早期发现医院感染的检验指标。

IL-15及其受体在HIV感染中表达及意义

目的研究人免疫缺陷病毒(HIV)感染者外周血单个核细胞(PBMC)中白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素15受体α(IL-15Rα)及解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)mRNA的表达,探讨其在HIV感染疾病进展中的作用。方法应用实时定量PCR(RT-PCR)检测9例HIV早期感染者(感染<1年,EHI组)、30例慢性HIV感染者(感染≥1年,CHI组)及9例健康对照(NC组)PBMC中IL-15、IL-15Rα、ADAM-17 mRNA水平。结果 CHI组PBMC中IL-15 mRNA的表达明显高于NC组(P<0.01);EHI组及CHI组PBMC中IL-15Rα、ADAM17 mRNA的表达明显高于NC组(P<0.05);HIV感染者PBMC中IL-15、IL-15Rα、ADAM17 mRNA的表达与病毒载量(VL)呈正相关(P<0.05); HIV感染者IL-15 mRNA表达与IL-15RαmRNA表达呈正相关(P<0.001), IL-15RαmRNA表达与ADAM17mRNA表达水平呈正相关(P<0.001)。结论 HIV感染后IL-15、IL-15Rα、ADAM17表达上调,皆与HIV病毒复制水平相关。

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ，并在大肠杆菌中克隆与表达。方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ，将其定向插入ｐＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组子ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ－１５表达量占菌体总蛋白的３０％，表达产物主要以包涵体形式存在。结论：本研究获得了序列正确的ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ克隆，并实现在Ｅ．ｃｏｌｉ中的高效表达。

表达白细胞介素-15重组人p53腺病毒联合免疫细胞治疗鼻咽癌的实验研究

目的 探究表达白细胞介素-15 （IL-15）重组人p53腺病毒（rAD-p53）联合免疫细胞治疗鼻咽癌的效果.方法 构建表达IL-15基因的rAD-p53/IL-15病毒;抽取健康志愿者的外周静脉血提取过继免疫细胞并进行细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞扩增培养;构建皮下鼻咽癌小鼠模型,并将其分为对照组、rAD-p53/IL-15组和rAD-p53/IL-15＋ CIK组,每组20只,对照组给予复制缺陷型腺病毒Ad-EGFP和磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照,rAD-p53/IL-15组瘤体内注射rAD-p53/IL-15腺病毒,rAD-p53/IL-15＋ CIK组瘤体内注射rAD-p53/IL-15腺病毒,并于尾静脉注射CIK细胞;观察三组小鼠瘤体内IL-15和p53含量及瘤体大小.结果 与对照组小鼠比较,rAD-p53/IL-15组和rAD-p53/IL-15＋ CIK组进行皮下鼻咽癌造模的小鼠瘤体内,IL-15和p53的含量显著增加（P＜0.05）;rAD-p53/IL-15组和rAD-p53/IL-15＋ CIK组小鼠的瘤体体积显著减小（P＜0.05）,且rAD-p53/IL-15＋ CIK组小鼠的瘤体体积减少的更多（P＜0.05）.结论 表达IL-15重组人p53腺病毒联合免疫细胞治疗鼻咽癌具有显著疗效.