白花蛇舌草多糖对异烟肼致肝损伤的影响及机制

目的探讨白花蛇舌草多糖(HDP)对异烟肼致肝损伤的影响及机制。方法以正常发育的具有肝脏特异性荧光的转基因斑马鱼为对象,分为正常组、模型组(4 mmol/L异烟肼)、HDP低浓度组(4 mmol/L异烟肼+50 mg/mL HDP)和HDP高浓度组(4 mmol/L异烟肼+100 mg/mLHDP),分组处理后观察斑马鱼肝脏荧光面积、荧光强度以及肝组织病理变化。以人肝L02细胞为对象,分为正常组、模型组(4mmol/L异烟肼)、HDP低浓度组(4mmol/L异烟肼+2mg/mLHDP)和HDP高浓度组(4mmol/L异烟肼+4mg/mLHDP),分组处理后检测细胞存活情况,细胞上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平及细胞裂解液中谷胱甘肽(GSH)含量,沉默信息调节因子1(Sirt1)、核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白的表达水平。结果与模型组比较,HDP低、高浓度组斑马鱼肝脏荧光面积和荧光强度(HDP低浓度组除外)均显著增加(P<0.05或P<0.01),肝损伤坏死特征均有不同程度改善。与模型组比较,HDP低、高浓度组L02细胞存活率,GSH含量(HDP低浓度组除外),Sirt1(HDP低浓度组除外)、Nrf2、NQO1、HO-1(HDP低浓度组除外)蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);ALT、AST(HDP低浓度组除外)水平均显著降低(P<0.05);存活细胞数量均明显增加,损伤或死亡细胞数量均明显减少。结论HDP对异烟肼诱导的肝损伤具有一定的改善作用,其机制可能与激活Sirt1/Nrf2信号通路、改善线粒体功能、提高抗氧化能力相关。

EGCG辐射保护作用的研究

采用MTT方法和脉冲场凝胶电泳方法 ,以人肝L0 2细胞株为研究对象 ,对没食子儿茶素没食子酸脂 (epigallocatechingallate ,EGCG)的辐射保护作用进行了研究。MTT结果表明 ,EGCG在 5— 5 0 μmol/L的浓度下 ,对细胞有明显的保护作用 ,并对细胞的修复有促进作用 ;脉冲场凝胶电泳方法结果显示 ,EGCG作用可减少辐射所致的DNA双链断裂水平。

两种细胞系用于建立体外脂肪肝模型的比较

目的对比油酸诱导肝癌细胞株HepG2、正常肝细胞株L02建立的肝细胞脂肪变性模型,通过检验复方蛋氨酸胆碱的防治作用,寻找简便、稳定的体外药物筛选模型。方法设正常组、HepG2模型组、HepG2不同浓度给药组、L02模型组、L02不同浓度给药组、用油酸诱导肝细胞脂肪变,复方蛋氨酸胆碱干预,以油红O染色镜下观察细胞内脂滴形成状况,并检测细胞上清中的ALT、AST、γ-GT水平。结果油酸刺激HepG2、L02肝细胞24 h,细胞内典型脂肪滴形成。复方蛋氨酸胆碱2次给药,药物难以使HepG2细胞内脂滴减少,L02细胞在加油酸48 h后油红O染色证明细胞内脂滴可减少,脂滴表达的红色IOD值,各给药组与模型组比较,差异有极显著性(P<0.01)。细胞上清液中ALT、AST、γ-GT,复方蛋氨酸胆碱各组与模型组比较差异有显著性,证实其对肝细胞损伤较小。结论L02比HepG2更适合作为体外的筛药细胞模型,油酸刺激L02细胞形成脂肪变,药物提前24 h干预,24 h后再给药1次,这种造模和给药方案可作为一种可行的脂肪肝细胞筛药模型使用。

何首乌含药血清对体外培养的人肝细胞活性的影响

目的:观察何首乌含药血清对体外培养的人肝细胞活性的影响,考察何首乌入血成分是否具有肝细胞毒作用。方法:采用血清药理学方法制备何首乌含药血清及空白对照组血清,作用于体外培养的人正常肝L02细胞和肝癌HepG2细胞,MTT法检测不同浓度血清对两种细胞活力的影响;倒置相差显微镜观察各浓度血清作用后两种细胞的形态变化;测定含药血清作用于两种细48 h后,细胞培养液转氨酶活性变化。结果:何首乌含药血清对人正常肝L02细胞和肝癌HepG2细胞的活力没有明显影响。两种细胞含药血清组与空白血清组相比,细胞形态都没有发生明显改变,细胞培养液转氨酶活性(ALT、AST)也没有显著差异(P>0.05)。结论:何首乌含药血清对体外培养的两种人源肝细胞活性均没有明显影响。

基于细胞色素氧化酶CYP2D6的何首乌肝细胞毒性及相关成分研究

目的探究何首乌及其主要成分对人肝细胞L02中细胞色素氧化酶CYP2D6 mRNA表达的影响以及抑制CYP2D6活性或表达对何首乌肝细胞毒性的影响及相关成分辨识。方法利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)确定何首乌水提物(Polygoni Multiflori Radix,PMR)及其主要成分对L02细胞CYP2D6 mRNA表达的影响;使用CYP2D6抑制剂奎尼丁初步探究PMR对CYP2D6低活性L02细胞系的细胞毒作用;构建CYP2D6沉默的L02细胞系L02-shCYP2D6,进一步研究L02细胞中CYP2D6表达降低对PMR及其主要成分肝细胞毒性的影响;可能的肝细胞毒性成分与人肝微粒体进行体外孵育,通过考察加入不同CYP450酶特异性抑制剂对其代谢消除率的影响,探究影响其代谢的主要CYP450酶。结果在实验浓度下,PMR和芦荟大黄素(AE)对CYP2D6 mRNA表达有显著抑制作用(P<0.01),大黄素(EM)无明显影响,2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)仅在高浓度有一定激活作用,其余浓度无影响;PMR联合奎尼丁作用于L02细胞,发现PMR在高浓度下对L02细胞有一定毒性(P<0.01),各浓度抑制剂与之联用后均明显加重了其肝细胞毒性(P<0.01);PMR及其主要成分作用于CYP2D6敲低的L02细胞系,除TSG在高浓度下提升了肝细胞毒性外(P<0.01),PMR、EM、AE在实验浓度范围内肝细胞毒性均显著增加(P<0.01);人肝微粒体体外孵育实验显示,CYP2D6为EM、AE重要的代谢酶。结论PMR能够抑制肝细胞中CYP2D6的表达,而CYP2D6的低活性或低表达能够加重PMR肝细胞毒性,其中主要的毒性成分为EM和AE。

红背叶根水提物对乙醇诱导的酒精性脂肪肝细胞的干预作用及可能机制

目的探讨红背叶根水提物对乙醇诱导的酒精性脂肪肝细胞的干预作用和可能机制。方法(1)采用不同浓度乙醇干预人肝L02细胞,检测细胞存活率以筛选适宜的建模浓度。(2)将L02细胞分为空白对照组和不同浓度红背叶根组,不同浓度红背叶根组经适宜浓度乙醇干预建模后,给予不同浓度红背叶根水提物干预,检测细胞存活率以筛选适宜的药物干预浓度。(3)将L02细胞分为空白对照组和0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125mg/mL红背叶根组,红背叶根组经适宜浓度乙醇干预建模后,给予相应浓度红背叶根水提物干预,检测并比较各组细胞的三酰甘油水平及陷窝蛋白1(Cav-1)mRNA表达水平。结果(1)使用80%的乙醇用于建模,将0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL作为红背叶根干预浓度。(2)各红背叶根组的三酰甘油水平及Cav-1 mRNA表达水平均高于空白对照组,且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL红背叶根组三酰甘油水平及Cav-1 mRNA表达水平依次降低(均P<0.05)。结论红背叶根水提物可能通过降低三酰甘油水平及Cav-1 mRNA表达,发挥防治酒精性脂肪肝的作用。

UPLC-QTOF/MS分析芫花诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础

目的:研究芫花提取物诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础。方法:选取人肝细胞L02作为体外实验模型,运用MTT法测定芫花提取物对细胞增殖的影响,并且采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)对芫花提取物及与L02细胞亲和后胞内化学成分进行定性分析。结果:芫花提取物对L02细胞的生长抑制呈明显的剂量依赖关系,48 h的IC50为(48.34±4.66)mg.L-1。通过UPLC-QTOF/MS鉴定的黄酮类成分主要有:芹菜素、3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮;二萜原酸酯类成分主要有:芫花酯戊、genkwanine L、芫花酯丙、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯庚、芫花酯乙、芫花酯己、芫花酯甲。在芫花提取物亲和的L02细胞中鉴定出3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮、芫花酯戊、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯乙、芫花酯甲。其中二萜原酸酯类成分芫花酯甲作用L02细胞48 h的IC50为(29.57±2.01)mg.L-1,黄酮类成分芫花素(0.1～100 mg.L-1)未发现对L02有显著的细胞毒作用。结论:芫花提取物对人肝细胞L02具有细胞毒作用,其中二萜原酸酯类成分与细胞有明显的亲和作用,并具显著的细胞毒作用,是芫花提取物中主要的活性物质。

大黄素对人胚胎肝细胞L02细胞株法尼醇X受体的调节作用

目的研究大黄素对人胚胎肝细胞L02细胞株法尼醇X受体（FXR）通路的调节作用。方法模型组采用孕二烯二酮（Guggulsterones）对L02细胞株的FXR基因干预，根据大黄素剂量分为高剂量、中剂量、低剂量组（50.0 μmol/L、25.0 μmol/L、12.5 μmol/L），另设对照组。采用实时荧光定量PCR与Western blot检测FXR及下游小异源二聚体伴侣受体（SHP）、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶2B4（UGT2B4）、胆盐输出泵（BSEP） mRNA及蛋白表达。结果1．模型组FXR mRNA及蛋白相对表达量（0.240±0.021、0.385±0.119）较对照组（1.000±0.088、1.000±0.223）显著降低，差异均有统计学意义（t＝14.62、4.21，均P〈0.01）；与模型组比较，大黄素高、中、低剂量组FXR mRNA相对表达量（0.755±0.083、0.817±0.097、0.547±0.080）显著升高，差异均有统计学意义（t＝10.42、10.03、6.39，均P〈0.01）；中剂量组FXR蛋白相对表达量（0.865±0.203）显著升高，差异有统计学意义（t＝3.53，P〈0.01）；高、中剂量组FXR mRNA相对表达量（0.755±0.083、0.817±0.097）均高于低剂量组（0.547±0.080），差异均有统计学意义（t＝3.11、3.70，均P〈0.01）。2.模型组SHP、UGT2B4、BSEP mRNA及蛋白相对表达量（0.148±0.025、0.205±0.039、0.184±0.020，0.458±0.130、0.255±0.170、0.303±0.100）较对照组（1.000±0.099、1.000±0.104、1.000±0.125，1.000±0.129、1.000±0.157、1.000±0.162）显著降低，差异均有统计学意义（t＝14.50、12.44、11.19、5.13、5.57、6.33，均P〈0.01）。高、中、低剂量组SHP、UGT2B4、BSEP mRNA相对表达量（0.610±0.058、0.514±0.041、0.707±0.062，0.755±0.108、0.800±0.086、0.727±0.076，0.470±0.070、0.582±0.050、0.500±0.108）较模型组（0.148±0.025、0.205±0.039、0.184±0.020）显著升高，差异均有统计学意义（t＝12.75、9.38、13.94、9.46、10.90、11.96、7.53、10.31、5.00，均P〈0.01）；高、中剂量组SHP、UGT2B4、BSEP蛋白相对表达量（0.658±0.091、0.624±0.113、0.607±0.097，0.868±0.194、0.883±0.099、0.913±0.131）较模型组（0.458±0.130、0.255±0.170、0.303±0.100）显著升高，差异均有统计学意义（t＝2.18、3.13、3.78、3.05、5.53、6.41，均P〈0.01），低剂量组SHP、BSEP蛋白相对表达量（0.645±0.135、0.572±0.076）不同程度升高，差异均有统计学意义（t＝1.73，P〈0.05，t＝3.72，P〈0.01）。大黄素高、中剂量组BSEP蛋白相对表达量（0.607±0.097、0.913±0.131）均高于低剂量组（0.572±0.076），差异均有统计学意义（t＝1.99、3.90，均P〈0.01）；高、低剂量组SHP、UGT2B4 mRNA相对表达量（0.610±0.058、0.470±0.070，0.514±0.041、0.582±0.050）均低于中剂量组（0.800±0.086），差异均有统计学意义（t＝3.75、6.47、3.83、3.42，均P〈0.01）；高、低剂量组UGT2B4、BSEP蛋白表达量（0.624±0.113、0.644±0.097，0.607±0.097、0.572±0.076）均低于中剂量组（0.883±0.099、0.913±0.131），差异均有统计学意义（t＝4.27、2.98、6.30、3.90，均P〈0.01）。结论Guggulsterones能抑制L02细胞株FXR及下游SHP、UGT2B4、BSEP基因表达，大黄素可通过对FXR基因表达上调，促进SHP、UGT2B4、BSEP基因表达上调，抑制胆汁淤积通路来保护肝细胞，但有剂量差异。

核因子-κB信号通路在自来水有机提取物致L02细胞炎性损伤中的作用

[目的]观察自来水有机提取物致正常人肝细胞株(L02细胞)炎性损伤中核因子-κB(NF-κB)信号通路的激活情况及其调控作用。[方法]采用固相萃取法提取自来水中的有机污染物。将L02细胞分别暴露于培养液(空白对照)、0.1%二甲基亚砜(溶剂对照)和0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 L/m L自来水有机提取物中24、48、72 h。采用免疫印迹方法观察NF-κB信号通路的激活情况;并使用ELISA法测定细胞培养液上清中白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。[结果](1)L02细胞染毒24、48、72 h,细胞活力在各剂量组均明显降低(P<0.05)。(2)L02细胞染毒24、48、72 h,NF-κB抑制蛋白的表达水平在0.625 0 L/m L以上剂量组均明显降低(P<0.05);p65蛋白表达水平在染毒24、48 h时点,仅在1.250 0 L/m L以上剂量组明显升高(P<0.05),而在72 h时点,0.625 0 L/m L以上剂量组即明显升高(P<0.05)。(3)L02细胞染毒24、48 h后,0.625 0 L/m L以上处理组的IL-8水平均明显升高(P<0.05);而染毒72 h,低剂量组(0.312 5 L/m L)的IL-8水平即可升高明显(P<0.05);染毒24 h,1.250 0 L/m L以上处理组的TNF-α水平明显升高(P<0.05);而染毒48、72 h,TNF-α水平在0.625 0 L/m L以上处理组即升高明显(P<0.05)。与24 h染毒组比较,48、72 h各染毒组的IL-8与TNF-α水平均明显升高(P<0.05)。(4)IL-8、TNF-α水平与NF-κB抑制蛋白表达水平均呈负相关关系(r=-0.851 0、-0.818 0,P<0.05),与p65蛋白表达水平呈正相关关系(r=0.816 0、0.865 0,P<0.05)。[结论]自来水有机提取物可剂量-依赖性及时间-依赖性地激活NF-κB信号通路,诱导IL-8及TNF-α的分泌,此可能为其诱发L02细胞炎性损伤的重要原因之一。

核因子I-B高表达对肝L02细胞中蛋白磷酸酶2A-B55δ靶向调控研究

目的构建核因子I-B基因(NFIB)真核表达重组质粒,应用于其高表达调控肝细胞中蛋白磷酸酶2A(PP2A)的B亚基基因转录的功能学验证。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得人NFIB mRNA片段,克隆入真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1),构建pEGFP-NFIB重组质粒后,分别给予250、500、1 000 ng转染永生化人正常肝L02细胞建立NFIB高表达细胞模型(相应设为250、500和1 000 ng剂量组),对照组为250 ng pEGFP-N1转染的L02细胞,荧光定量聚合酶链反应检测NFIB mRNA,激光共聚焦和免疫印迹法(WB)检测核因子-1(NF-1)蛋白水平。电泳迁移率实验分析与NF-1相结合的DNA序列的特异性,荧光素酶报告基因检测PP2A-B55δ亚基基因(PPP2R2D)启动子区的转录活力,RT-PCR和WB检测细胞内PPP2R2D mRNA和PP2A-B55δ蛋白水平。结果双向测序证实pEGFP-NFIB重组表达质粒构建成功。与对照组比较,各剂量组L02细胞中NFIB mRNA相对水平增高(P<0.01),增强型绿色荧光蛋白、NFI-B蛋白表达水平均升高(P<0.05)。NF-1可与PPP2R2D基因启动子区(2R2Dp)-462G>A不同多态性序列结合,NFIB高表达使L02细胞中2R2Dp-462G启动子活力下降(P<0.05),PPP2R2D mRNA和PP2A-B55δ蛋白水平均升高(P<0.05)。结论成功构建人NFIB真核表达重组质粒,应用于人肝细胞中证实NF-1靶向PPP2R2D的功能学调控作用。