OA对人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402增殖的影响和对细胞凋亡的诱导作用研究

以人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402为研究对象,通过MTT法、细胞外部形态观察、Annexin V-FITC&PI双染法及TUNEL法等方法,研究了腹泻性贝毒的主要组分大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)对其增殖的影响及对细胞凋亡的诱导作用。结果表明:OA对人两株细胞的增殖均有显著的抑制作用,24 h IC50分别为65ng/mL和60 ng/mL,且这种抑制作用呈剂量依赖性。OA导致两株细胞的形态均发生明显变化:细胞变圆,脱壁,细胞膜形成泡状突起,最终形成膜包裹的凋亡小体。Annexin V-FITC和PI双染法及TUNEL法检测均发现:OA能够诱导两株细胞发生不同程度的凋亡,且凋亡细胞的比例与OA的浓度相关。以上结果表明:OA能够通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而对人肝细胞和肝癌细胞造成影响,且这种影响的程度与OA的浓度和作用时间密切相关。

大田软海绵酸对HL-7702肝细胞毒性效应的研究

[目的]探讨大田软海绵酸(okadaic acid,OA)对HL-7702肝细胞的毒性效应。[方法]通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、细胞形态学观察及流式细胞术等方法,从细胞增殖、细胞凋亡等方面探讨OA对HL-7702肝细胞的毒性效应。[结果]与溶剂对照组相比,OA对HL-7702肝细胞增殖有明显的抑制作用,细胞增殖抑制率随着OA浓度的增加而增加,同时随着染毒时间的延长,细胞增殖抑制率也明显增加;与对照组相比,作用HL-7702肝细胞24h后,5nmol/LOA可明显诱导细胞发生凋亡。[结论]OA可以通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的方式对HL-7702肝细胞产生毒性效应,且呈现剂量-效应关系。

纳米氧化锌对人正常肝细胞HL-7702的毒性作用研究

[目的]研究食品添加剂纳米氧化锌对人正常肝细胞HL-7702的毒性作用。[方法]采用不同浓度(5、10、25、50、100、250μg/ml)的纳米氧化锌对HL-7702细胞进行染毒;光学显微镜下观察细胞的形态学变化;采用MTT法检测纳米氧化锌对HL-7702细胞生长活性的影响;应用荧光探针活性氧检测技术检测细胞内活性氧(ROS)的生成情况。[结果]纳米氧化锌可引起HL-7702细胞形态变化;MTT检测显示,纳米氧化锌对HL-7702细胞的生长活性具有明显的抑制作用;荧光探针活性氧检测发现,染毒后HL-7702细胞内ROS的生成量增加。[结论]纳米氧化锌作为一种新型锌源,建议控制其添加量或使用量。

玉米低聚肽促HL-7702人肝细胞增殖作用

采用MTT法测定细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期及细胞存活率,对玉米低聚肽的促HL-7702人肝细胞增殖作用进行了研究。结果显示:玉米低聚肽在1～10 g/L内,可促进肝细胞生长,其促进作用与肽浓度呈正相关;给予肝细胞玉米低聚肽24 h后,细胞周期中S期及G2/M期细胞的比例上升;并且在此浓度范围内,玉米低聚肽对肝细胞存活率及形态影响较小。研究表明,玉米低聚肽有促进HL-7702人肝细胞增殖及DNA合成的作用,可显著提高肝细胞活力,提示其在保肝护肝中可能具有一定作用。

锌和N-乙酰半胱氨酸对镉致人正常肝细胞HL-7702凋亡的拮抗作用研究

目的:探讨氯化锌(ZnCl2)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)对镉所致人正常肝细胞HL-7702凋亡的拮抗作用。方法:体外培养的人正常肝细胞HL-7702分别以0、10、20、40、80、160μmol/L的氯化镉(CdCl2)处理24h,ZnCl2和NAC预处理组分别在各浓度的CdCl2处理前以25.0、50.0、100.0、200.0μmol/L的氯化锌和2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L NAC预处理24 h,MTT法测定各组HL-7702细胞的相对存活率;流式细胞术Annexin-V-PI双染法检测细胞凋亡百分率。结果:随着镉处理浓度的增加,氯化镉对细胞活力的抑制作用增强,40、80、160μmol/L的镉处理组细胞相对存活率明显降低,50μmol/L锌预处理组在CdCl2剂量为40、80μmol/L时,细胞相对存活率显著高于相应剂量的单纯镉处理组(P<0.01),10 mmol/L NAC预处理组只在40 mmol/L CdCl2组细胞相对存活率显著高于相应剂量的单纯镉处理组(P<0.05);与0μmol/L镉处理组比较,40、80、160μmol/L镉处理组HL-7702细胞的凋亡百分率显著升高(P<0.01);与40μmol/L镉处理组比较,100μmol/L锌预处理组细胞凋亡率显著降低(P<0.01);5.0、10.0、20.0 mmol/L NAC预处理可有效拮抗镉诱导的HL-7702细胞凋亡(P<0.05)。结论:锌和NAC对镉致HL-7702细胞损伤和凋亡有明显的拮抗作用。

胎儿肝脏中一种抑制HL-60细胞生长的因子初步研究

胎儿肝脏中存在着两类抑制HL-60细胞生长的抑制物,一类是精氨酸酶,它是一类非特异性的细胞毒剂,在我们的实验条件下,不仅对HL-60细胞,而且对正常人骨髓CFU-GM也具有相似的抑制细胞生长的毒性作用。此外,还存在着一类较小分子的抑制物,它对HL-60细胞生长的抑制作用明显高于对人骨髓CFU-GM的作用,因此,在一定程度上,这是一类对HL-60细胞生长具有选择性作用的抑制物。

辛基酚对5-羟色胺转运及受体通路的影响

目的通过观察人肝7702细胞暴露于辛基酚(OP)后5-羟色胺(5-HT)转运体SERT、5-HT3b受体表达以及5-HT水平的变化,探讨OP对5-HT转运通路和受体结合通路的影响。方法实验分5个组,分别为OP高(5.0μg/L)、中(1.0μg/L)、低(0.2μg/L)剂量组、盐酸氟西汀组和空白对照组,体外细胞培养48 h,采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中5-HT含量的变化,运用实时荧光定量PCR法检测转运体SERT及5-HT3b受体的表达。结果中、高剂量组细胞上清液中5-HT含量高于空白对照组(P<0.05),细胞中5-HT3b受体的表达降低(P<0.05);低、中、高剂量组细胞中SERT的表达均低于空白对照组(P<0.05);与盐酸氟西汀组检测结果一致。结论 OP可引起5-HT再摄取障碍,同时减少5-HT3b受体的表达,对机体5-HT代谢网络的转运通路及受体结合通路产生毒效应作用。

^(60)Co γ射线诱发人正常肝细胞HL-7702 HAVCR2和MXR7基因表达变化研究

目的探讨电离辐射诱导人正常肝细胞HL-7702甲型肝炎病毒受体2(HAVCR2)和MXR7基因的表达变化,为寻找辐射致肝脏损伤早期诊断标志物提供实验依据。方法将对数生长期的人正常肝细胞HL-7702分为10组,利用中国辐射防护研究院钴-60(60Co)照射装置对各组肝细胞照射,吸收剂量率为1.29 Gy/min,吸收剂量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 Gy,利用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测肝细胞HL-7702 HAVCR2和MXR7基因的变化,分析剂量-反应关系。结果 HAVCR2基因表达在照射后4、24 h总体上调;其中,0.2～0.8 Gy剂量组在照射后24 h基因相对表达量与照射剂量具有很好的剂量-反应关系,满足回归方程:y=0.14x2-0.48x+1.34;1.0～3.0Gy剂量组在照射后24 h,基因相对表达量与照射剂量呈现很好的剂量-反应关系,满足回归方程:y=0.44 x+0.56。MXR7基因表达在照射后4、24 h较对照组显示出明显差异;其中,0.2～0.8 Gy剂量组MXR7基因表达在照射后4 h与对照组相比总体上调,但随照射剂量增大,上调幅度降低;照射后24 h,其基因表达未见明显规律;1.0～5.0 Gy剂量组MXR7基因表达在照射后24 h整体上调,且基因的表达与照射剂量呈现一定的剂量相关性,满足方程为y=0.57x+0.43。结论电离辐射可以诱导人正常肝细胞HL-7702 HAVCR2和MXR7基因的差异表达,且基因表达与照射剂量存在一定的剂量相关性。

姜黄素下调PI3K/AKT/mTOR通路抑制人肝癌细胞系增殖

目的观察姜黄素对体外培养人肝癌细胞系HL-7702增殖的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养HL-7702细胞,不同浓度的姜黄素(0、10、20、40和80μmol/L)处理48 h。PI3K/AKT抑制剂LY294002联合姜黄素处理细胞。分别用MTT法检测细胞增殖,用Western blot法检测细胞内PI3K、AKT、m TOR、Bax、Bcl-2及活化的caspase-3的蛋白含量。结果姜黄素可以浓度依赖性的抑制HL-7702细胞增殖,增加细胞中PI3K、AKT和m TOR的磷酸化水平(P<0.05)。姜黄素可诱导HL-7702细胞凋亡,增加Bax和活化的caspase-3的含量(P<0.05),减少Bcl-2的含量(P<0.05)。LY294002与姜黄素联用后,姜黄素对细胞增殖及凋亡无明显作用。结论姜黄素可抑制人肝癌细胞系HL-7702增殖,诱导细胞凋亡,作用机制可能与其下调PIK/AKT/m TOR信号通路的活性有关。

电离辐射对人肝细胞MXR7基因表达的影响及放射性工作人员外周血MXR7的表达分析

为探讨电离辐射对人正常肝细胞及外周血MXR7基因表达的影响,利用^(60)Coγ射线对培养的人肝细胞HL-7702进行照射,同时,抽取某工厂放射性工作人员外周血,通过实时荧光定量PCR对照射后的各剂量组肝细胞及放射性工作人员外周血MXR7基因的表达情况进行检测分析。结果表明,电离辐射可诱导人正常肝细胞MXR7基因的差异表达,且基因表达与照射剂量存在一定的剂量相关性;放射性工作人员外周血MXR7基因表达与非放射性工作人员相比显著升高。

积雪草酸对实验性胆汁淤积型肝损伤的影响

目的:研究积雪草酸改善胆管结扎小鼠肝纤维化的作用及其机制。方法:在体实验,小鼠麻醉后打开腹腔,用缝合线结扎胆总管,建立淤胆型肝损伤小鼠模型。手术后将C57小鼠随机分为假手术组、模型组、积雪草酸15 mg/kg组和积雪草酸30 mg/kg组。假手术组和模型组给予0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na),其余两组给予0.5%CMC-Na稀释的积雪草酸,各组均连续口服灌胃5 d。末次给药后空腹12 h,眼眶采血检测天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)。处死小鼠,取肝脏及脾脏称重并计算肝脏指数、脾脏指数;将肝脏组织切片进行HE染色、Masson染色和TUNEL染色;采用实时荧光定量PCR检测肝组织炎症因子基因水平,包括前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2),IL-6,TNF-α和趋化因子配体3(CCL3);蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平。细胞实验采用甘氨鹅脱氧胆酸钠诱导人肝HL-7702细胞损伤,分别加入0.1、0.3、1和3μmol/L积雪草酸,MTT法检测细胞存活率,AnnexinⅤ/PI流式细胞术检测细胞凋亡。结果:积雪草酸给药后的小鼠血清AST、ALT水平明显低于模型组;显微镜下观察,给药组肝组织胶原纤维和细胞凋亡明显减少;炎症因子基因水平降低,Bax蛋白表达水平降低,Caspase3活化减少,Bcl2表达水平增加。细胞实验显示,低浓度积雪草酸能够促进HL-7702细胞增殖,抑制凋亡。结论:积雪草酸通过抑制肝细胞凋亡,减轻胆管结扎模型小鼠肝纤维化,同时能缓解炎症,改善肝损伤。

人胎肝细胞分泌的低分子抑瘤物对白血病细胞的抑制作用

本工作证明了在胎儿组织中存在一类低分子天然肿瘤抑制物,它是胎儿组织细胞生成和分泌的,对瘤株细胞和原代白血病细胞有选择性抑制作用。初发期或复发期急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓在体外液体培养条件下与肝细胞上清及其甲醇提取物共同孵育4d,可使所有病例的骨髓AML—CFU降低到不可检出的程度。因而,低分子天然抑瘤物是天然肿瘤免疫中的一个组成部分,它在肿瘤的诊断和治疗中有着深远的意义。

胎儿肝脏中抑制 HL-60细胞生长的低分子抑制物的研究

在胎儿肝脏中存在着丰富的精氨酸酶以及一类分子量<10000dal 的抑制物,它们对 HL-60细胞有明显的细胞毒性作用。然而,与精氨酸酶不同的是,这类低分子抑制物对HL-60细胞比对人骨髓 CFU-GM 有更强的抑制细胞生长的作用。

致肝损伤毒物四氯化碳体外染毒剂量的选择

目的探讨四氯化碳(CCl4)致肝脏损伤体外实验模型的染毒剂量。方法以不同浓度CCl4作用于正常人二倍体肝细胞HL-7702细胞,使其终浓度分别为0(阴性对照),5,10,20,30 mmol/L和40 mmol/L。采用CCK8法检测不同浓度CCl4对肝细胞活性的影响,采用生化分析法检测染毒后肝细胞培养上清中谷草转氨酶(AST),谷丙转氨酶(ALT),乳酸脱氢酶(LDH),碱性磷酸酶(AKP)的水平。结果①染毒24 h后,肝细胞活性呈剂量依赖性降低,其中20-40 mmol/L CCl4对肝细胞活性有明显抑制作用,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。②染毒24 h后,随着CCl4染毒剂量的增加,各染毒组肝细胞培养上清中AST的活性有逐渐升高的趋势,其中40 mmol/L CCl4染毒组与阴性对照组比较有统计学差异(P<0.05);各染毒组肝细胞培养上清中ALT的活性逐渐增加,其中10-30 mmol/L CCl4染毒组与阴性对照组相比显著升高(P<0.05);各染毒组肝细胞培养上清中AKP和LDH的活性与阴性对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 10 mmol/L CCl4在对HL-7702肝细胞活性无明显影响的情况即可引起肝细胞培养上清中ALT的活性升高,对肝细胞膜造成一定的损伤,可作为其肝损伤机制研究的体外染毒剂量。

重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验

目的:构建并鉴定含人OX40-IgG1融合基因的重组腺病毒载体,并感染人肝HL-7702细胞,筛选出最佳感染剂量并检测OX40Ig的表达情况,为进一步用于器官移植后的抗排斥治疗奠定基础。方法:根据基因库公布的人OX40和hIgG1 Fc片断序列设计特定引物,通过聚合酶链反应扩增并鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。随后与pAdeasy-1腺病毒质粒以氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞,重组质粒经鉴定正确后,大量扩增为腺病毒载体。再经293A细胞包装、扩增并纯化后感染HL-7702肝细胞,筛选出最佳感染剂量,并采用间接免疫荧光法检测其中外源性OX40Ig基因的表达,采用ELISA法测定肝HL-7702细胞上清中OX40Ig蛋白的含量。结果:转移质粒pTOX40Ig经酶切及测序鉴定正确。重组腺病毒质粒经酶切鉴定正确,并成功转染了293A细胞。得到的病毒液经纯化扩增后进一步感染肝HL-7702细胞,经筛选,10 MOI为最佳感染剂量,并且可以检测到OX40Ig目的基因及其蛋白的表达。结论:成功构建了重组腺病毒载体AdOX40Ig,并且可在肝细胞HL-7702中表达相应的目的基因及蛋白。

高、低侵袭性肝癌干细胞模型的建立及生物学特性鉴定

目的:采用人肝癌细胞HCCLM3建立高、低侵袭性肝癌干细胞(H/L-ILCSCs)模型,并与HCCLM3和正常肝细胞HL-7702相比较鉴定其生物学特性。方法:(1)利用Transwell小室迁移实验分离获得高、低迁移性HCCLM3细胞,再采用Transwell小室侵袭实验进一步分离获得高、低侵袭性HCCLM3细胞。(2)采用免疫磁珠分选法以CD133^+为分子标志分离高、低侵袭性HCCLM3细胞,获得H/L-ILCSCs。(3)检测H/L-ILCSCs、HCCLM3细胞和正常肝细胞HL-7702干细胞表面标志分子CD133^+、CD90^+、CD44^+的表达。(4)采用CCK-8法、Transwell侵袭、平板克隆形成及免疫缺陷动物成瘤实验,检测H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3及HL-7702的生长增殖、体外侵袭、干细胞球形成及体内裸鼠成瘤能力。结果:表面标志分子CD133^+、CD90^+、CD44^+在H-ILCSCs中高表达,而L-ILCSCs中CD133^+高表达,CD90^+和CD44^+低表达。L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞的生长增殖、体外侵袭、平板克隆形成及体内成瘤能力均低于H-ILCSCs。L-ILCSCs细胞的生长增殖和体外侵袭能力均低于HCCLM3细胞。此外,L-ILCSCs不能形成克隆球和移植瘤。结论:从正常人肝癌细胞HCCLM3中可以分离和富集H/L-ILCSCs,且二者生物学特性存在差别。

N-琥珀酰壳聚糖对牛血红蛋白和正常肝细胞毒性研究

目的探究N-琥珀酰壳聚糖(NSCS)对牛血红蛋白(BHb)和正常肝细胞(HL-7702)的毒性。方法在模拟人体生理条件下,以BHb为研究对象,采用紫外-可见分光光度法、荧光光谱法和同步荧光光谱法结合,探究NSCS对BHb的毒性;同时以HL-7702为研究对象,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法考察NSCS对HL-7702的细胞毒性。结果紫外-可见分光光度法和MTT法结果表明,NSCS的毒性较弱,且取代度对NSCS毒性的影响较小。荧光光谱显示,NSCS可以猝灭BHb的内源性荧光,且猝灭作用随取代度的增大略有增强。其猝灭机制主要为动态猝灭,二者间作用力主要为静电作用力和疏水作用力。同步荧光光谱显示,NSCS对BHb的构象基本无影响。结论 NSCS对BHb和HL-7702细胞的毒性均较弱。

两种非酒精性肝细胞脂肪变性模型的比较

目的比较50％胎牛血清、油酸分别建立HL-7702细胞脂肪肝的离体细胞模型的优缺点。方法采用50％胎牛血清、油酸分别建立HL-7702细胞脂肪肝的离体细胞模型，并用四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性，油红O染色观察细胞内脂滴数量、甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯含量，比较两种方法的优缺点。两组计量数据比较用t检验，多个样本均数比较采用方差分析。结果0．5mmol／ml油酸组和50％胎牛血清组都能建立较好的肝细胞脂肪变性模型，其中0．5mmol／ml油酸诱导的细胞脂变更为明显，细胞内甘油三酯含量为（893．2±89．1）μg／mg，50％胎牛血清组细胞内甘油三酯含量为（411．6±126．6）μg／mg，两组比较，F=72．288，P〈0．01，差异有统计意义。结论0．5mmol／ml油酸诱导的肝细胞脂肪变性模型具有实用性和可重复性。该模型为非酒精性脂肪性肝病的研究提供了一条有效、简便、可行的新途径。

朱砂及含朱砂制剂的肝肾毒性研究

目的探讨朱砂、含朱砂制剂(柏子养心片)及甲基汞对大鼠的体内外毒性,为其临床安全用药提供科学依据。方法(1)对比甲基汞、朱砂及柏子养心片体外对人肝HL-7702细胞和人肾近曲小管上皮HK2细胞的毒性,计算半数抑制浓度(IC_(50))。(2)SD大鼠随机分为对照组,朱砂组0.1 g/kg,柏子养心片0.2、0.4、0.8 g/kg组,甲基汞组0.001 g/kg,每天ig 1次,连续给药90 d后,取血及肝、肾组织;试剂盒法检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)水平,测汞仪固体直接进样法检测肝、肾组织中汞蓄积量,并对大鼠肝脏和肾脏做组织病理学检查。结果体外试验表明,朱砂、柏子养心片及甲基汞对HL-7702细胞的IC_(50)分别为7.852、6.035、0.009 5 g/L;对HK2细胞的IC_(50)分别为6.297、4.484、0.008 9 g/L。亚慢性毒性试验表明,甲基汞组大鼠肝、肾组织中汞蓄积量及血清中ALT、AST、CREA、BUN值均显著高于对照组,而朱砂及柏子养心片(高、中、低剂量)组与对照组比较均没有显著性差异;甲基汞组大鼠肝脏呈现肝细胞变性,肾脏可见明显肾小管损伤,而朱砂及柏子养心片(高、中、低剂量)组与对照比较没有明显差异。结论朱砂及柏子养心片的体内外毒性均显著低于甲基汞,在目前药典规定的临床用量下使用安全性较好。