北京地区人偏肺病毒膜表面糖蛋白G编码基因和特征的分析

为了解北京地区人偏肺病毒（hMPV）膜表面糖蛋白G编码基因的特征，提取2003年和2004年各6份hMPV阳性的临床呼吸道标本中的RNA，经用随机引物合成cDNA后，用特异性引物扩增G蛋白全基因，克隆至pBST载体中并进行测序。用生物软件与GenBank中hMPV的基因序列进行比较和种系进化分析。12株hMPV可以分为两个主要的进化簇1和2。每个进化簇还可以再分为不同的亚进化簇。3株（2003年）hMPV属于进化簇1；9株（3株2003年和6株2004年）hMPV属于进化簇2。这12株hMPV G蛋白基因的核苷酸长度在624～711nt，使用了两种不同的终止密码，编码的氨基酸长度为208～236aa，蛋白质分子量为22．9～25．8kD。与进化簇2相比，进化簇1的3株hMPV都出现了3个核苷酸的缺失，但未改变读码框架。同一进化簇内的hMPV G蛋白基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95．7％～100％和91．8％～100％，不同进化簇间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为56．3％～57．4％和34．3％～38．2％。疏水性分析表明这12株hMPV G蛋白是典型的Ⅱ型跨膜锚定蛋白，分别与两个进化簇代表株的疏水图一致。这些hMPV的G蛋白氨基酸的替换集中在胞外区。它们都含有高百分比的脯氨酸（P）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T），含有相当数量的位于胞外区的O-连接糖基化化点。这些hMPV的G蛋白的N连接糖基化位点数目和位置不尽相同。通过对G蛋白基因的分析显示，2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种不同的进化簇。基因分析品示hMPV的G蛋白是高精基化的膜表面蛋白，具有与同属于副粘病毒科、肺病毒亚科的人呼吸道合胞病毒（hRSV）的G蛋白相似的基因特征，推测其功能和在感染免疫中的作用相当于hRSV的G蛋白，但有待进一步深入研究予以证实。

A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析

[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果。[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定。[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/Hong Kong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98％同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能。

天津地区人偏肺病毒G蛋白特性分析

目的了解天津地区人偏肺病毒（hMPV）G蛋白特性，为深入研究（hMPV）奠定基础。方法采用RT—PCR方法扩增hMPV的G基因片段，测序后通过生物信息学软件分析核苷酸同源性，绘制种系发生树，并对推导的G蛋白氨基酸序列的糖基化位点、跨膜序列及二级结构进行预测。结果天津地区hMPVG蛋白由217～238个氨基酸组成。种系发生树分析显示，hMPV可分为A2a、A2b和B23个亚型，A2b为优势流行型。A2亚型内的核苷酸同源性在90．1％～99．5％，推导的氨基酸同源性在80．4％～99．1％；A、B亚型之间核苷酸同源性为57．4％～60．3％，推导的氨基酸同源性为30．3％～37．1％。hMPVG蛋白的S和T总含量在30．9％～34．0％之间，A和B型间差异无统计学意义（P〉0．05）。N-糖基化位点在2～6之间。10株A2亚型hMPVG蛋白的跨膜区为N-端33～55位氨基酸，1株B2亚型hMPVG蛋白为N-端27-49位氨基酸。G蛋白氨基酸变异多发生在膜外区。二级结构预测显示，柔性结构占G蛋白氨基酸总数的62．7％～84．1％，其中以无规则卷曲为主，占60．8％～84．1％。该区域也多集中在膜外区，成为抗原表位的可能性较大。结论天津地区hMPV的优势流行型为A2b，其G蛋白特性有地区流行特点。

北京地区2株人偏肺病毒的P和M蛋白基因序列分析

目的 进一步了解北京地区人偏肺病毒 (hMPV)编码基因的特征。方法 从分属于hMPV的两个不同基因进化簇 (即基因型 )的 2份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增P和M全基因 ,克隆至pBS T载体中并进行测序 ,与GenBank中的hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析。结果 经扩增BJ1816和BJ1887的P基因全长为 885个核苷酸 ,编码 2 94个氨基酸 ;M基因全长 76 5个核苷酸 ,编码 2 5 4个氨基酸。BJ1816和BJ1887的P和M蛋白基因与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性 (91.9%～ 10 0 % )。BJ1816和BJ1887间P基因的氨基酸同源性仅为 85 .8% ,而M基因的氨基酸同源性为 96 .9%。结论 BJ1816和BJ1887的P和M蛋白基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似 ,不同型的hMPV的P基因之间比M基因显示了更强的基因多样性。

北京新发现的人偏肺病毒N蛋白编码基因的序列分析

目的 了解新近从北京地区发现的人类偏肺病毒 (humanmetapneumovirus ,HMPV)N蛋白编码基因的特征。方法 从经RT PCR检测HMPV阳性的临床鼻咽洗液标本中进行HMPVN蛋白全基因扩增、克隆至pUCm T载体中并进行测序 ,与GenBank中的多株HMPVN蛋白基因序列进行比较和进化树分析。结果 经扩增并测序 ,标本BJ1816和BJ1887N蛋白基因全长为 1185bp ,编码 394个氨基酸。BJ1816N蛋白基因与国际上第一株HMPV分离株NDL0 0 1和GenBank中其它的多株HMPV的核苷酸和氨基酸同源性分别为 86 .2 %～ 99.0 %和 96 .2 %～ 99.7%。BJ1887N蛋白基因与以上进行比较的各株HMPV的核苷酸和氨基酸同源性分别为 86 .6 %～ 97.0 %和 96 .4 %～ 99.5 %。BJ1816和BJ1887之间N基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为 86 .6 %和 96 .4 %。提示BJ1816和BJ1887分属于HMPV的两个不同的基因进化簇。结论 从基因水平进一步证明新近发现的婴幼儿肺炎的新病原确为HMPV ,提示北京地区婴幼儿中同时存在两个不同进化簇 (即基因型 )的HMPV感染。

2012年石家庄地区急性呼吸道感染病例人偏肺病毒的分子流行病学特征

目的通过分析石家庄地区急性呼吸道感染病例中人偏肺病毒（human metapneumovirus,hMPV）的感染情况、临床特点和基因特征,掌握石家庄地区hMPV流行特点。方法采集2012年1~12月,河北省儿童医院和石家庄市人民医院两所医院门诊呼吸道感染病例标本297份,收集相关临床资料,采用多重RT-PCR方法检测包括hMPV在内的15种呼吸道病毒核酸。hMPV阳性标本通过RT-PCR扩增M基因片段,并进行核酸测序。用Mega 6软件比对序列和绘制系统进化树。结果从297份标本中检出阳性标本130份,总阳性率为43.77%,其中hMPV阳性标本5份,核酸阳性率为1.68%。患者年龄为2个月~57岁。1例病例混合感染鼻病毒和副流感病毒。临床诊断为上呼吸道感染和支气管肺炎。3株间核苷酸同源性为92.0%~99.9%。基因进化分析显示石家庄Hebei2012-1为A2b基因型,Hebei2012-2和Hebei2012-3属于B1基因型。结论石家庄地区hMPV流行基因型别为A2b和B1型。

北京地区人偏肺病毒融合蛋白F编码基因的序列分析

目的进一步了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)编码基因的特征.方法在原先工作的基础上,从分属于hMPV的两个不同基因进化簇(即基因型)的两份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增F蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序,与GenBank中hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析.结果 BJ1816和BJ1887的F基因全长均为1620个核苷酸,编码539个氨基酸.BJ1816和BJ1887 F蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为83.8%和94.4%,与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性(98.3%～99.6%).BJ1816和BJ1887的F蛋白是典型的I型糖蛋白,具有与迄今已发现的hMPV相同的裂解位点(RQSR).BJ1816和BJ1887之间F2亚单位的氨基酸同源性高于F1亚单位的同源性(96.9% vs 93.8%);除位于羧基末端的跨膜区和胞质尾区外,F1亚单位的其余部分较保守(95.4%);糖基化位点保守.种系进化分析显示BJ1816和BJ1887属于不同的进化簇.结论 F蛋白的序列分析进一步证明BJ1816和BJ1887分属于不同的基因型,其F蛋白的基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似,是病毒的膜表面糖蛋白,提示其在病毒的感染与免疫中起到重要的作用.

来自肺炎患儿的A1基因亚型人偏肺病毒全基因组序列分析

人偏肺病毒（human metapneumovirus,HMPV）是婴幼儿呼吸道感染的重要病原之一。本研究目的在于分析在HMPV监测中发现的少见型别A1基因亚型BJ-1610的全基因组序列,为HMPV的进一步研究提供数据支持。BJ-1610来源于一名患有肺炎的3月龄女婴的鼻咽洗液标本。对该毒株进行全基因组RNA分段扩增、测序、序列拼接并分析其基因组特征、变异程度及是否存在重组等现象。BJ-1610株基因组全长为13 406nt（KU821121）。BJ-1610与HMPV参考株进行全基因和各蛋白核苷酸和氨基酸序列比较,显示全基因组的核苷酸相似性范围为81.2%-98.4%,其中相似性最高的为澳大利亚株（KC562226）,而SH和G基因则与其他澳大利亚株相似性更高。系统进化分析发现BJ-1610与HMPV A1基因亚型参考株位于同一分支,显示了与相似性分析相同的特征。对BJ-1610的膜表面蛋白F、SH和G蛋白序列进行分析结果显示,F蛋白最为保守,SH基因编码区的终止密码发生了突变,导致终止密码后移15位,长度由552bp变为567bp;G蛋白氨基酸序列突变较多,并导致N-糖基化位点的减少。HMPV作为儿童呼吸道疾病的重要病原之一,对其流行株基因组的分析将对其流行特征、遗传进化、致病机理、疫苗研制和抗病毒药物研发等方面的研究产生积极的推动作用。

人偏肺病毒广州分离株全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的偏肺病毒基因组分子结构特点和基因型类型.方法 参考GenBank上的偏肺病毒00-1株（AF371337）基因组设计分段扩增引物,进行RT-PCR分段扩增偏肺病毒基因组,克隆于T载体上,序列测定,用Clustal W/X、DNASTAR、MEGA4.1等软件分析基因组序列.结果 偏肺病毒hMPVgz01全基因组为13 327 bp,提交到GenBank上的序列号为GQ153651,有8个开放阅读框（open reading frames,ORFs）,基因组结构为：3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5;将hMPVgz01株全基因组核苷酸序列与GenBank上的偏肺病毒全基因组序列进行Clustal W比较,发现与偏肺病毒的A组相似性较高,为92%～97%,与A2b组的BJ1887相似性为最高,而与B组相似性为81%,与C组的禽偏肺病毒为71%.将hMPVgz01株的N、F、G基因与偏肺病毒的A1、A2、B1、B2的相对应基因进行相似性比较,同样也是与A2b型的相似性为最高,因此确认广州地区的hMPVgz01株为A2b型.结论 广州地区儿童感染的偏肺病毒hMPVgz01株全基因组序列为13 327 bp,GenBank 序列号为GQ153651,hMPVgz01与偏肺病毒的A2b型相似性最高,确认hMPVgz01株属于偏肺病毒A2b型.