人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响

目的:观察人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响。方法:取成人(自愿者)鼻腔嗅黏膜,制成细胞悬液,分别用DF12培养基(对照组)、10 ng/m l NGF+DF12培养基、10%胎牛血清的DF12培养基、10 ng/m l NGF+10%胎牛血清的DF12培养基、10%人血清的DF12培养基和10 ng/m lNGF+10%人血清的DF12培养基培养细胞,并用差时贴壁法纯化嗅鞘细胞。采用MTT法观察上述各种培养液对嗅鞘细胞增殖的影响。结果:加入与不加入NGF培养液组之间的光密度无统计学意义(P>0.05);胎牛血清组、人血清组与对照组之间的光密度有显著统计学意义(P<0.01);胎牛血清组和人血清组之间的光密度无统计学意义(P>0.05)。结论:人嗅鞘细胞的体外培养对血清具有依赖性,人自体血清培养可替代胎牛血清用于嗅鞘细胞的体外培养、扩增。本研究结果为人嗅鞘细胞的自体移植治疗脊髓损伤提供了可行性基础。

人胚胎嗅鞘细胞与神经干细胞联合移植修复大鼠脊髓全横断损伤的研究

目的:探索人胚胎嗅鞘细胞(hOECs)与神经干细胞(hNSCs)联合移植修复大鼠脊髓全横断损伤的可行性。方法:制作Wistar大鼠脊髓全横断模型,9—10d后,分别将取材自人胎脑的hOECs和hNSCs移植到脊髓损伤处(联合移植组),并设hOECs移植组、hNSCs移植组和对照组,移植术后第1、2、4、6、8、10周进行BBB运动功能评分,取材行荧光化学(Hoechst33342)和免疫组织化学染色(P75、NF-200、GFAP、Synaptophysin)观察。结果:术后4—10周,hNSCs组、hOECs组和联合移植组的BBB评分较对照组明显提高(P<0.05),其中,联合移植组的运动功能改善更显著。免疫组化染色显示,hNSCs可以在损伤脊髓内存活10周以上,并分化为神经元或星形胶质细胞,联合移植组和hOECs组P75染色呈阳性反应,hOECs与hNSCs联合移植可促进神经突触的形成,恢复神经元之间的联系。结论:hOECs和hNSCs联合移植可促进脊髓全横断损伤大鼠神经突触的再生,改善其肢体运动功能。

人胚胎嗅鞘细胞移植修复大鼠脊髓全横断损伤

[目的]探索人胚胎嗅鞘细胞（hOECs）移植修复大鼠脊髓全横断损伤的可行性。[方法]分离、培养并鉴定人胚嗅鞘细胞，24只Wistar大鼠，随机分为实验组和对照组，均行T10节段脊髓全横断。术后第9～10d，实验组、对照组分别移植Hoechst33342标记的hOECs 5μl（2．5×10^5个细胞）、DMEM—F12培养基5μl。移植术后第1、2、4、6、8、10周进行BBB运动功能评分，取材行荧光化学（Hoechsd3342）和免疫组织化学染色（P75、NF-200、Synaptophysin）。双盲条件下进行数据统计。[结果]移植的hOECs可以在损伤脊髓内存活10周以上，可向损伤脊髓头尾两端迁移；术后4～10周实验组的BBB运动功能评分明显高于对照组（P〈0．01）；P75染色实验组呈阳性反应；NF-200和Synaptophysin免疫组化染色，实验组神经纤维、突触数目和密度都较对照组高。[结论]hOECs移植对脊髓全横断损伤大鼠运动功能恢复具有促进作用。

成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养与免疫学特点

目的探讨成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养方法及嗅鞘细胞(OECs)的免疫学特点。方法通过手术取成人嗅区黏膜7例,将其消化为单个细胞后采用差速贴壁法除去成纤维细胞。倒置显微镜下行形态学观察,并利用p75、S100、GFAP抗体对嗅鞘细胞进行免疫荧光化学染色,共焦显微镜下进行各种抗体阳性率的统计。结果共焦显微镜下可见嗅黏膜细胞中S100和p75阳性细胞多见,GFAP阳性细胞在嗅黏膜细胞中较少见。一般在同一细胞上可见S100和p75共同表达,而GFAP与S100、p75未见有共同表达现象;p75阳性细胞胞体大小和形态也大不相同。经统计S100和p75阳性细胞的平均百分率为(35.0±8.3)%。结论成功进行了成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养。

人胚嗅神经鞘细胞的体外培养

目的:建立人胚胎嗅神经鞘细胞(OECs)的体外培养体系.方法:选取3～6个月的流产儿,采用原代培养的方法,在原代培养后的不同时间,用组织免疫化学染色的方法鉴定细胞并计算阳性率.找到细胞数量和阳性率俱佳的时间段,为以后的移植工作打下基础.结果:成功培养出人胚胎OECs,在原代培养后的2～5d主要为巨噬细胞状、多极状,与成纤维细胞很难分别,7～15d主要为扁平的双极、三极形态,突起细长,细胞阳性率可达90%,21d以后为双极、三极形态.结论:自胚胎培养OECs的方法实用可行,方法简单,为利用OECs修复脊髓损伤进入临床提供了条件.

嗅鞘细胞移植联合应用GDNF对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用

目的:探讨嗅鞘细胞(OEC)移植和人重组胶质细胞源性神经营养因子(recombinant human glial cell line-derivedneurotrophic factor,rhGDNF)对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用。方法:采用无创血管夹在成年大鼠制作视神经不全损伤模型,分为玻璃体腔注射rhGDNF、视神经损伤处注射OEC、rhGDNF+OEC联合治疗组和对照组。在损伤前、损伤后即刻及伤后1,2,4,8和12wk检测伤眼闪光视觉诱发电位。结果:视神经损伤后即刻闪光视觉诱发电位波形呈熄灭状。伤后1wk各治疗组和对照组潜伏期基本恢复至损伤前水平。振幅恢复缓慢,伤后1～2wk治疗组与对照组比较无显著差异(P>0.05);4wk以后rhGDNF组和OEC组与对照相比间差异显著(P<0.05),GDNF+OEC组与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。8wk时对照组恢复至损伤前的43.1%,GDNF治疗组恢复至损伤前的51.5%,OEC治疗组恢复至损伤前的57.4%,而GDNF+OEC联合治疗组恢复至损伤前的68.7%,12wk后达75%。结论:嗅鞘细胞(OEC)移植和rhGDNF对大鼠视神经不全损伤后视神经功能的恢复有明显的促进作用,二者联合治疗效果更显著。

人胚嗅球嗅鞘细胞原代培养的实验研究

目的拟建立人胚胎嗅球嗅鞘细胞的培养方法并探讨这些细胞在活性、纯度方面是否具备临床应用水平。方法用含有促进细胞生长的谷氨酰胺、转铁蛋白、生物素、硒酸纳的无血清纯化液纯化嗅鞘细胞,胰蛋白酶消化收集细胞,制成单细胞悬液。采用台盼蓝染色法进行活性测定,P75NGFR和S-100双标免疫荧光染色鉴定,以Hoechst复染鉴定OECs的纯度。结果可见比较典型的嗅鞘细胞:双极或梭形、多突起形和扁圆形,主要以梭形和多突起形细胞为主。细胞活性大于95%,纯度大于90%。结论实验建立的人胚胎嗅球嗅鞘细胞原代培养的方法可行,细胞活性大于95%,纯度和均一性已达到临床应用水平。

纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘形成相关蛋白表达的影响

目的:探讨纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘相关蛋白表达的影响。方法:将体外培养的成人鼻粘膜嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架,用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照底物,培养14天后用扫描电镜观察细胞的形态学变化并对细胞内髓鞘形成相关蛋白2,3-环核苷3-磷酸二酯酶(2′,3′cyclic nucleotide 3′phosphodiesterase,CNPase)和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)进行免疫荧光染色定位和免疫印迹半定量测定,分析纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞CNPase和MBP表达的影响。结果:人嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架后,其形态为长条带状,细胞成束排列,方向一致。细胞内CNPase和MBP表达水平明显高于对照组。结论:纤维蛋白支架与人嗅鞘细胞具有很好的生物相容性并可促进细胞表达髓鞘相关蛋白CNPase和MBP;将该组织工程支架用于移植治疗脊髓损伤,有利于再生神经纤维的髓鞘形成。

干细胞标志蛋白在成人鼻黏膜嗅鞘细胞的表达

目的建立成人鼻黏膜嗅鞘细胞的体外培养方法,探讨干细胞标志蛋白在人嗅鞘细胞的表达及其意义,为嗅鞘细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤提供可行性研究资料。方法用鼻内镜自成人(鼻中隔偏曲伴黏膜肥厚者)鼻腔活体钳取部分嗅区黏膜,经胰酶消化制成细胞悬液。细胞接种于玻璃培养瓶,用含10%胎牛血清的F12培养基培养、传代、扩增。用免疫细胞化学或免疫荧光染色和免疫印迹方法检测SOX-2、SOX-10、Nestin、NCAM、NGFRp75和S100-β在第7代嗅鞘细胞的表达。结果成人嗅黏膜细胞经过多次传代培养后,嗅鞘细胞逐渐成为优势细胞,该细胞高表达干细胞标志蛋白和嗅鞘细胞标志蛋白。结论成人嗅黏膜细胞体外培养可获得高产量的许旺细胞(Schwann cells,Scs)样嗅鞘细胞,该细胞具有干细胞特性(stemness)和很强的增殖能力,可作为自体细胞移植治疗中枢神经系统损伤的种子细胞。

嗅鞘细胞移植修复大鼠及人类脊髓损伤的Meta分析

目的:综合评价嗅鞘细胞(OECs)移植治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的价值。方法:计算机检索美国国立图书馆(MEDLINE)、PubMed、Ovid-Medline、Ovid-BIOSIS Previews、CNKI、VIP、CBM数据库中关于嗅鞘细胞移植治疗SCI大鼠及患者的随机对照研究。检索时间均为2000年1月至2012年6月。对符合纳入标准的研究以修改后Jadad量表为标准进行质量评价,收集原始数据,采用RevMan5.0软件进行Meta分析。结果:共28篇文章符合标准,Meta分析显示:15篇以大鼠为模型的实验中,OECs组细胞移植6周后,其后肢运动功能(BBB)评分高于对照组,其差异有统计学意义[WMD=1.24,95%CI(1.12,1.35),P<0.00001];感觉诱发电位(SEP)潜伏期短于对照组,而波幅高于对照组,其差异有统计学意义[潜伏期WMD=-2.33,95%CI(-3.05,-1.60),P<0.0001;波幅WMD=0.27,95%CI(0.24,0.30),P<0.00001];运动诱发电位(MEP)波幅高于对照组,差异有统计学意义[MEP振幅WMD=-0.20,95%CI(-0.55,0.15),P<0.00001];痛觉测量(Plantar test)潜伏期短于对照组,差异有统计学意义[WMD=-1.05,95%CI(-1.38,-0.72),P<0.00001];受损区脊髓横断面积大于对照组,差异有统计学意义[WMD=0.93,95%CI(0.79,1.07),P<0.00001]。在SCI患者的13篇文献中,OECs移植后患者的运动、轻触觉及痛觉功能评分均高于移植前,差异具有统计学意义[运动WMD=-5.53,95%CI(-7.04,-4.01),P<0.00001;轻触觉WMD=-11.22,95%CI(-12.98,-9.47),P<0.0001;痛觉WMD=-9.65,95%CI(-11.41,-7.88),P<0.000011]。结论:就目前为止的研究结果分析,OECs移植能促进SCI大鼠及人的脊髓再生及功能改善。

人嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养及生物学特性

目的细胞移植是目前的研究热点,本文主要研究人嗅粘膜嗅鞘细胞(OM-OECS)的分离、培养、纯化、鉴定,来观察其生长情况,分析其生物学特性,为具有神经功能障碍的患者实行同种细胞移植提供一种可行的方法。方法选取意外交通事故或意外疾病、事故急性死亡3h内及经蝶窦手术的患者,征得家属同意,取鼻中隔后1/3鼻粘膜,免疫吸附法结合采用P75抗体包被的培养皿进行纯化人OM-OECs,免疫组化方法进行细胞的鉴定。结果 OM-OECs体外培养过程中,采用免疫吸附法使抗体与间充质来源的成纤维细胞进行特异结合从而将其去除,P75抗体包被的培养皿促进了OECs的贴壁使其与杂质细胞进一步分离,在体外培养10d后,细胞增殖最快,经P75、GFAP免疫组化双标染色显示呈双阳性,计数阳性细胞率达90%以上,说明从人嗅粘膜分离培养OECs具有较高的纯度。结论从人鼻粘膜取材,可以分离培养出OECs,体外生长增殖旺盛,并且经纯化后具有较高的纯度。

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。

人胚胎嗅球嗅鞘细胞的制备

目的探讨人胚胎嗅鞘细胞(OECs)培养与纯化的优化方法。方法取3～5个月流产胚胎,无6菌条件下取出嗅球,解剖镜下仔细剥离嗅球表面的软膜组织和血管,消化后用条件培养基制成密度为10个细胞/ml细胞悬液,利用差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法进行无血清纯化液细胞纯化培养,对不同培养时期进行观察75和行PNGFR(低亲和力神经营养因子受体)和FBN(纤维粘连蛋白)免疫荧光染色鉴定。结果此制备法可以有效去除成纤维细胞,获得纯度90%嗅鞘细胞,显微镜下观察嗅鞘细胞有卵圆形的胞体和细长的突触,细胞多呈75为双极或多极形,免疫荧光染色NGFRP阳性细胞百分数为80%-90%。结论本培养纯化方法可行,可获得符合临床细胞移植治疗要求细胞制剂。

嗅粘膜间充质干细胞与嗅粘膜嗅鞘细胞在人鼻粘膜中分布的研究

目的:探讨人嗅粘膜间充质干细胞(human olfactory mesenchymal stem cells,hOM-MSCs)与嗅鞘细胞(human olfactory mucosa olfactory ensheathing cells,hOM-OECs)在鼻粘膜组织中的分布情况以指导自体移植时鼻粘膜组织的取材。方法:通过鼻内窥镜在受试者嗅区粘膜区与呼吸区取鼻粘膜组织,通过细胞免疫荧光染色检测hOM-MSCs与hOM-OECs在鼻嗅区粘膜及呼吸区粘膜组织中的分布情况。结果:hOM-MSCs分布于嗅区粘膜与呼吸区粘膜的固有层中,但在嗅区细胞数多于呼吸区;hOM-OECs分布于嗅区粘膜中,且上鼻甲中细胞数多于中鼻甲处。结论:人鼻粘膜的嗅区粘膜中广泛分布hOM-MSCs和hOM-OECs,建议细胞移植可在嗅区的上鼻甲处粘膜取材。