慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

目的通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶(h TERT)基因的口腔黏膜上皮细胞(OMECs),探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法。方法提取293T细胞总RNA,应用聚合酶链反应(PCR)法扩增h TERT基因全长,构建重组慢病毒载体p LVX-puro-h TERT。包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测h TERT基因m RNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了p LVX-puro-h TERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中;感染细胞与正常OMECs形态相似,呈铺路石样生长;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,h TERT在感染细胞中高表达,与正常细胞相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过慢病毒法成功建立了过表达h TERT的OMECs稳定细胞系,为构建高效、稳定增殖的人永生化OMECs细胞系奠定了实验基础。

口腔粘膜癌前病变HPV感染与p53蛋白过度表达

目的 :探讨口腔粘膜癌前病变p5 3蛋白过度表达与人类乳头状病毒 (HPV)和EB病毒 (EBV)感染。 方法 :应用免疫组织化学DAB法及PCR对 33例口腔粘膜癌前病变组织和 34正常口腔粘膜组织 p5 3蛋白、HPV、EBV进行检测。结果 :(1) 33例口腔粘膜癌前病变中 ,10例 p5 3蛋白过度表达 ,阳性表达率为 30 .3% ,3例HPV感染阳性 ,阳性率为 9.0 9% ;正常口腔粘膜没有检测到p5 3蛋白过度表达和HPV感染 ,二者比较有统计学意义 (P<0 .0 1)。 (2 ) 33例口腔粘膜癌前病变组织和 34正常口腔粘膜组织没有检测到EBV病毒感染。 结论 :口腔粘膜癌前病变存在p5 3蛋白过度表达和人类乳头状病毒 (HPV)感染。

正常口腔黏膜和口腔鳞癌中人乳头瘤病毒感染率的研究进展

黏膜高危型HPV-16、HPV-18感染是宫颈癌的主要致病因素,且与口腔鳞癌的发生密切相关,但目前对口腔鳞癌中HPV的感染率和亚型的分布尚不十分清楚。作者系统查阅了目前已经发表的有关HPV在正常口腔黏膜或口腔鳞癌中感染率和亚型分布的文献资料,对正常口腔黏膜、口腔鳞癌中人乳头瘤病毒的感染率的研究进展进行了综述。

鹿茸多肽CNT14对口腔黏膜成纤维细胞增殖、迁移的影响

目的:探讨鹿茸多肽CNT14促进口腔黏膜成纤维细胞(human oral mucosa fibroblasth,hOMF)增殖和迁移的作用和相关分子机制。方法:采用活/死细胞染色评价鹿茸多肽CNT14对hOMF细胞的生物安全性,CCK-8法检测鹿茸多肽CNT14对hOMF细胞增殖的作用,细胞划痕实验检测鹿茸多肽CNT14对hOMF细胞迁移的影响。采用蛋白质免疫印迹检测鹿茸多肽CNT14刺激后hOMF细胞内α-SMA、TGF-β1、Smad2和p-Smad2蛋白的情况;Smad2抑制剂对鹿茸多肽CNT14诱导成纤维细胞活化的影响。在新西兰大白兔体内构建角化龈缺损模型,取再生的牙龈组织进行H-E染色;免疫组织化学检测新西兰大白兔再生的牙龈组织中α-SMA、TGF-β1、Smad2和p-Smad2蛋白的表达量,补充验证鹿茸多肽CNT14促进口腔牙龈组织再生的能力。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:活/死细胞染色实验中,鹿茸多肽CNT14处理hOMF细胞后,细胞存活率在95%以上。鹿茸多肽CNT14刺激hOMF细胞后,与对照组相比,增殖和迁移率显著增加(P<0.05)。鹿茸多肽CNT14刺激hOMF细胞后,细胞内α-SMA、TGF-β1、Smad2和p-Smad2蛋白表达量显著升高(P<0.05)。经Smad2抑制剂阻断鹿茸多肽CNT14诱导成纤维细胞后,细胞内α-SMA表达下降。动物实验中,H-E染色显示,CNT14处理组新西兰大白兔口腔黏膜创口的炎症反应比对照组轻。免疫组织化学染色结果显示,CNT14处理新西兰大白兔牙龈创口后第9天和第11天,再生的牙龈组织中α-SMA、TGF-β1、Smad2和p-Smad2表达量与对照组相比显著升高(P<0.05)。结论:鹿茸多肽CNT14对hOMF细胞具有良好的生物安全性,能促进口腔黏膜成纤维细胞增殖和迁移,细胞内α-SMA、TGF-β1、Smad2和p-Smad2蛋白表达量升高,有效促进牙龈组织再生。

高危型人乳头瘤病毒16 E5基因对口腔肿瘤致病机制的研究进展

人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌发病的重要危险因子之一,近些年研究表明其在口腔肿瘤及癌前病变中检出率也较高,提示其与口腔肿瘤发病有关。现有研究主要集中于其E6、E7基因的功能,其他基因涉及较少,本文对近年来兴起的对人乳头瘤病毒E5基因与口腔肿瘤关系的研究及进展作一简要综述。

直流生物电刺激活化PTEN/Akt/mTOR信号通路促进人口腔黏膜成纤维细胞增殖的研究

目的:探讨直流电刺激(direct current stimulation,DCS)对人口腔黏膜成纤维细胞(human oral mucosa fibroblast,hOMF)增殖的影响及相关机制。方法:以不同强度(0、10、25、50、100μA)、时长(0、5、10、30、60 min)、频率(0、1、2、3次/d)的DCS作用于hOMF,应用CCK-8法检测细胞增殖情况。通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测DCS组与对照组(接种的细胞贴壁后,随机设置DCS组及对照组)24、48 h细胞培养上清液中表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的浓度。通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测经DCS后的hOMF中蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)及磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian rapamycin target protein,p-mTOR)、磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)的表达水平。结果:通过检测DCS强度梯度、时间梯度、频率梯度的吸光度值可知,25μA的电流强度(P<0.01)、10 min的刺激时长(P<0.001)及2次/d的刺激频率(P<0.01)为hOMF的显著增殖刺激条件。相较于对照组,DCS组24 h和48 h细胞培养上清液中VEGF的浓度均有所升高,24 h培养上清液中的VEGF浓度升高更为明显(P<0.01)。在不同时长的DCS下,刺激5、10 min后的p-mTOR和p-Akt的蛋白表达升高(P<0.05),PTEN的蛋白表达降低(P<0.001)。结论:DCS可促进hOMF的增殖,诱导细胞因子VEGF的高表达,可能与PTEN/Akt/mTOR信号通路的激活有关。

Tiger17促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖和迁移

目的观察在不同浓度Tiger17作用于人口腔黏膜成纤维细胞(hOMF)不同时间后对细胞增殖和迁移的影响。方法培养hOMF细胞,CCK8和划痕实验检测不同浓度Tiger17作用于hOMF细胞不同时间后细胞增殖和迁移的变化;Western Blot检测hOMF细胞表达TGF-β1、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的水平。结果100μg/mL和200μg/mL Tiger17对hOMF的增殖活性在48 h明显高于对照组(P<0.05);100μg/mL Tiger17对hOMF的迁移率在24 h和48 h均明显高于对照组(P<0.01);不同浓度的Tiger17作用于hOMF 24 h和48 h后,细胞表达TGF-β1、p-Erk1/2蛋白升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Tiger17使hOMF细胞表达TGF-β1、pErk1/2升高,促进hOMF细胞的增殖和迁移。

浓缩生长因子纤维蛋白膜复合重组人表皮生长因子活性蛋白多肽修复口腔黏膜的等效损伤模型

背景:口腔黏膜的完整性和功能性对于隔绝外界刺激和抵御致病微生物的入侵有着极其重要的生物学意义。近年来,富自体浓缩生长因子与重组人表皮生长因子已然成为机体软组织损伤再生与修复领域中的两大研究热点。目的:探讨富自体浓缩生长因子联合重组人表皮生长因子复合纤维蛋白膜对于口腔黏膜等效损伤的修复价值。方法:分别制备富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜与富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜联合重组人表皮生长因子复合纤维蛋白膜。将人牙龈成纤维细胞与人永生化角质形成细胞分别接种于两种纤维蛋白膜上,组织形态学染色观察细胞增殖量。将24只BALB/c-裸鼠随机分为4组,A组为正常对照,B、C、D组在背部制作处于肌层之上的创面,C组在背部创面上覆盖富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜,D组在背部创面上覆盖复合纤维蛋白膜,术后第3周末,通过组织形态学、免疫学评价各组创面的修复效果,生物力学检测各组修复组织的抗拉伸能力。结果与结论:①苏木精-伊红、SP免疫组化及免疫荧光染色显示,人牙龈成纤维细胞与人永生化角质形成细胞在两种纤维蛋白膜上生长良好,其中复合纤维蛋白膜上的细胞数量明显多于富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜;②苏木精-伊红与Masson染色显示,B组表皮层基本愈合,棘细胞层厚度减低,胶原纤维量少且排列不连续;C组角细胞层、棘细胞层、基底细胞层出现不同程度的增厚,上皮钉突减少,胶原纤维粗大密集,包绕新生血管;D组表现与C组相似,但胶原纤维、成纤维细胞及新生血管数目明显增加;③修复组织拉应力峰值大小顺序为:A组>D组>C组>B组(P<0.05);④结果表明,相较于富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜,富自体浓缩生长因子联合重组人表皮生长因子复合纤维蛋白膜不仅可促进人牙龈成纤维细胞与人永生化角质形成细胞的附着增殖,而且可促进口腔黏膜等效损伤愈合,增加损伤局部的胶原纤维含量及抗拉伸强度,表现出更佳的修复价值。

应用人自体血清培养人口腔黏膜上皮的实验研究

目的研究人自体血清培养人口腔黏膜移植生长的生物学特性,为组织工程化尿道提供新材料。方法将人自体血清培养黏膜移植于裸鼠体内,分别于移植后2、3、4、6周观察培养黏膜生长与转归,应用anti-HLA免疫荧光鉴定成活黏膜组织属性,应用抗人Ⅳ型胶原及抗人层黏蛋白为基底膜形成指标。结果裸鼠体内移植培养黏膜成活生长分化良好,anti-HLA免疫荧光证实为移植的培养人黏膜组织;免疫组化发现移植后3周开始形成基底膜,4周形成完整的基底膜。结论自体血清培养的人口腔黏膜可形成功能完整的上皮组织。

重组人白介素-11防治鼻咽癌同步放化疗口腔黏膜损伤的效果观察

目的：观察重组人白介素-11含漱液对鼻咽癌患者同步放化疗所致口腔黏膜损伤的防治作用。方法：将62例采用IMRT（调强适形放疗技术）放疗加DF（顺铂＋5-氟尿嘧啶）方案化疗的鼻咽癌患者随机分为观察组和对照组。对照组予常规口腔护理，用生理盐水漱口，出现Ⅱ级口腔黏膜损伤后给予相应处理。观察组在常规口腔护理基础上加用重组人白介素．11稀释液漱口。结果：观察组患者的口腔黏膜反应程度轻于对照组（X2=9．5，P〈0．05），溃疡愈合时间短于对照组（t=3．47，P〈0．05），患者体重下降低于对照组（X2=14．56，P〈0．05）。结论：重组人白介素-11对防治鼻咽癌患者同步放化疗所致口腔黏膜损伤有显著效果，可以减轻患者痛苦，值得临床推广应用。

GP-PCR检测口腔粘膜中HPV的研究

为了解口腔粘膜中人乳头瘤病毒的感染情况，诈者采用通用引物介导的聚合酶链反应（GP－PCR）技术，对临床正常口腔粘膜（NOM），口腔扁平苦藓（OLP），口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的人乳头瘤病毒（HPV）进行检测。结果：30例口腔粘膜中，HPVDNA阳性率43．3％，其中NOM28％，OLP46．7％、（JSCC57．1％。其结果表明：临床正常和病变口腔粘膜中存在多种型别的HPVDNA．此外，GP可作为普查口腔粘膜HPV的较好方法。

人乳头状瘤病毒16型与促癌物TPA协同作用诱发人胚口腔细胞恶性转化研究

目的 研究人乳头状瘤病毒 16型 (HPV16 )与TPA(12 O tetradecanog 1phorbol 13 acetate)协同作用在scid小鼠体内诱发人胚口腔细胞的恶性转化。方法 制备包装含有HPV 16E6 E7基因的逆转录病毒 ,用此病毒感染人胚口腔粘膜 ,将组织块接种于scid小鼠右侧肩部皮下 ,共分为 4组 :实验组为感染病毒的口腔粘膜和TPA ,共接种 8只小鼠 ;病毒组为感染病毒的口腔粘膜 ,共接种 6只小鼠 ;促癌组为正常口腔粘膜和TPA ,共接种 6只小鼠 ;对照组为正常口腔粘膜 ,共接种 5只小鼠。于接种第 3日起在左侧肩部皮下注射TPA ,每周一次。观察 16周后处死动物 ,对瘤组织进行病理诊断 ,并作聚合酶链反应 (PCR)检测HPV 16E6 E7基因。结果 实验组成瘤率为 7 8,其他 3组成瘤率皆为 0 6、0 6、0 5。实验组肿瘤组织的病理学检查结果证实为生长活跃的纤维组织细胞瘤 ,在肿瘤组织中用PCR检测到HPV 16E6 E7基因。结论 口腔细胞在感染含有HPV 16E6 E7基因的逆转录病毒后 。

组织工程化人口腔黏膜移植对裸鼠创面修复作用研究

目的评价组织工程化人口腔黏膜移植对裸鼠创面的修复作用。方法该研究于2016年11—12月在中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心完成。随机选取健康雄性裸鼠8只(3～4周龄,体重为14～15 g),用0.8%戊巴比妥钠麻醉,在其颈部及背部各制备大小约1.0 cm×1.0 cm的缺损,颈部缺损用组织工程化人口腔黏膜移植修复,背部缺损用真皮基质(acellular dermis matrix,ADM)移植修复。饲养8 d后取下移植皮片,HE染色观察组织特点。结果 HE染色发现,组织工程化人口腔黏膜移植物形成类皮肤组织结构,但部分上皮细胞脱离生物支架及ADM开始降解;而ADM移植物表面未见上皮细胞爬行。结论组织工程化人口腔黏膜移植能促进裸鼠创面修复。

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响

目的:探索白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞(KB细胞)凋亡和增殖的影响。方法:分别培养孢子型白色念珠菌和菌丝型白色念珠菌,取健康志愿者的颊粘膜制备KB细胞,分别加入孢子型白色念珠菌(孢子组)和菌丝型白色念珠菌(菌丝组),另外取单纯KB细胞作为对照组。对比分析各组细胞凋亡率及各个周期的细胞数,统计分析各组细胞增殖指数(PI)。结果:菌丝组凋亡率显著高于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组在G0/G1期的细胞比例均显著低于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组在S期和G2/M期的细胞比例均显著高于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组的PI显著高于孢子组和对照组(P<0.05)。结论:菌丝型白色念珠菌可诱导KB细胞凋亡率的上升及改变KB细胞周期变化,并引起KB细胞的PI升高,对于临床上治疗口腔念珠菌病具有重要的指导意义。

舌体鳞状细胞癌中人乳头瘤状病毒感染的Meta分析

目的探讨人乳头瘤状病毒(HPV)感染导致舌体鳞状细胞癌(OTSCC)的风险。方法计算机检索MEDLINE、Embase、Cochrane图书馆Central、Web of Science、VIP、CNKI、万方、中国生物医学文献库,收集建库至2019年10月1日国内外报道的有关OTSCC与HPV感染的病例对照研究,运用Review Manager 5.3软件分析OTSCC中HPV感染和HPV16感染情况。结果共纳入6篇文献,其中5项研究涉及HPV感染率,Meta分析显示,OTSCC组HPV感染率高于对照组(RR=0.93,95%CI:0.69~1.25),但差异无统计学意义(P>0.05);4项研究涉及HPV16感染率,Meta分析显示,OTSCC组HPV16感染率高于对照组(RR=11.14,95%CI:3.13~39.65),差异有统计学意义(P<0.05)。结论HPV感染存在于正常口腔黏膜,以低危型为主,HPV16感染是患OTSCC的危险因素。