Preliminary Identification of Human Nonserum Oviduct Specific Proteins by Using Electrophoresis and Immunoblotting Analysis

The present paper reported the preliminary results of identification of humannonserum oviduct specific proteins. The 1D-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and 2D-SDS-PAFE in conjunction with the immunoblotting assay were used in the present study. The results showed that the nonserum oviduct specific proteins with MW130, 100 and 80 kD existed in human oviduct fluid or oviductal extract. In addition, the antibody against pig oviduct antigens could more strongly cross-react with human oviduct antigens, mainly recognizing 130,116 and 100 kD proteins from human oviduct. It is suggested that in human oviduct there are some specific antigens possessing some similar epitopes to those in pig oviducts. This result seems to be consistent with predominant cross reactivity existing in antigens of porcine and human zona pellucida.

原代和传代培养的人输卵管上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响

为了检测人输卵管上皮细胞对早期胚胎体外发育的影响，将小鼠２细胞胚胎与人输卵管上皮细胞进行体外共培养．结果显示：无论原代培养还是传代培养的人输卵管上皮细胞都可使胚胎发育率提高，发育速度加快．经传代４次以后的细胞对胚胎发育的促进作用有下降的趋势，所以传代第１至第４代是应用于共培养的最佳选择．同一代细胞中已贴壁稳定生长的细胞对胚胎发育的促进作用比刚经传代尚未贴壁的细胞大．

不孕与宫颈人乳头瘤病毒感染的关系研究

目的:调查不孕患者宫颈人乳头瘤病毒(HPV)的感染率及亚型分布。方法:采用快速导流杂交法对217例输卵管不孕患者和174例非输卵管不孕患者进行21种HPV亚型检测。结果:391例不孕患者的HPV阳性率为17.90%,其中输卵管不孕患者的HPV阳性率为20.28%,非输卵管不孕患者的HPV阳性率为14.94%,两组差异无统计学意义(χ2=1.869,P>0.05)。HPV阳性的不孕患者中HPV高危型占82.86%,高危型中检出率最高的是HPV 58,其次是HPV 52。输卵管不孕组和非输卵管不孕组HPV感染均以高危型为主,两组间HPV高危型感染率差异无统计学意义(χ2=1.343,P>0.05)。结论:HPV高危型感染可能是女性不孕症的危险因素之一,且HPV阳性不孕患者中绝大部分为HPV高危型。

人类输卵管上皮细胞培养

从１６例妇女的正常输卵管标本中获取壶腹部上皮细胞建立体外培养并传代．通过倒置显微镜和相差显微镜观察细胞形态及生长状况．所有标本的细胞均可在培养的６～９ｄ形成融合的单层细胞、并可传代４～６次，每代历时５～７ｄ，最长的培养可维持３５ｄ，与提供标本的妇女的月经周期及年龄关系不大．无论是原代培养还是传代培养，均以上皮样细胞占绝大多数，该细胞用免疫细胞化学角蛋白（Ｋｅｒａｔｉｎ）染色呈阳性．传代后期，成纤维细胞数量有所增加，该细胞用波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）染色呈阳性．

吗啡对体外培养的人正常输卵管黏膜上皮细胞内MOR mRNA表达的影响

目的:研究吗啡对体外培养的人输卵管粘膜上皮细胞的μ阿片受体信使核糖核酸(MOR mRNA)表达的影响。方法:体外分离培养人输卵管粘膜上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法进行鉴定;将细胞分为对照组、吗啡组(10-4、10-5、10-6、10-7mol.L-1),通过RT-PCR的方法半定量分析吗啡对人输卵管粘膜上皮细胞MOR mRNA表达的影响。结果:吗啡组人输卵管粘膜上皮细胞中的MOR mRNA表达较对照组显著下降(P<0.05),且与吗啡浓度负相关(r=-0.966,P<0.05)。结论:外源性阿片类药物吗啡抑制人输卵管粘膜上皮细胞μ阿片受体mRNA的表达。

鸡卵清蛋白基因调控序列指导人促红细胞生成素转基因鸡的制备

本研究将鸡卵清蛋白 5!@端调控区调控人促红细胞生成素的pOV -hEPO特异表达载体用脂质体包埋 ,和供体细胞融合后 ,显微注射入 4 5 0枚受体胚盘 ,采用代用蛋壳法培养制备转基因鸡 ,PCR和斑点杂交检测外源基因已整合入早期鸡胚胎生殖系统 。

鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响,为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区,用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列,获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体,分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体,通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明:受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A替换3′-调控区的pOV3K;无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K,重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用,应当包括在鸡输卵管表达载体中。

含重组人组织激肽释放酶降血压鸡蛋的开发

通过将人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,KLK1)cDNA克隆入自行构建的鸡输卵管特异表达载体pOV中,获得重组载体pOVK经脂质体包裹后,经翅静脉等途径注射产蛋鸡,在收集的鸡蛋蛋清中检测到KLK1活性,表达量高达45U/mL蛋清,有效表达持续7d左右。用含2～4UKLK1的蛋清饲喂高血压大鼠,可使其血压降低70mmHg,5d后回升至饲喂前水平。试验结果表明,在鸡蛋清中表达的重组KLK1口服具有降血压作用,可用于研制降血压保健蛋。

胎儿输卵管上皮细胞的分化

研究采用光镜和电镜技术观察了10～38周胎儿输卵管上皮细胞特别是纤毛细胞的发育和分化.光镜下10周胎儿输卵管壶腹部管腔狭小,上皮为较原始的单层柱状上皮,12周粘膜上皮出现小的皱褶,16～17周形成短的绒毛样突起,19～32周渐形成复杂的粘膜皱襞,至38周粘膜皱襞已接近成体.电镜下17周上皮中偶见单纤毛细胞,胞质内细胞器较发达,糖原含量丰富,19周出现少量纤毛细胞,胞质细胞器发达,可见溶酶体,此时纤毛较短,不具9×2+2微管结构,非纤毛细胞也有各种细胞器,但不含溶酶体.20周～30周纤毛细胞仍稀少,至32周以后纤毛细胞数量逐渐增多,其胞质中细胞器发达,糖原丰富,纤毛具有典型的9×2+2微管结构,36～38周可见形态分化较完好的纤毛细胞,非纤毛细胞顶端明显突向管腔,甚至落入管腔中,胞质内未见膜包的分泌颗粒.

鸡输卵管暂态表达人溶菌酶的研究

目的:建立暂态表达人溶菌酶(hLYZ)的鸡输卵管生物反应器,以寻求一种生产药用hLYZ的有效方法。方法:将hLYZcDNA克隆入鸡输卵管特异表达载体pOV1和pOV2,将获得的重组表达载体pOV1LYZ和pOV2LYZ与一定比例的聚乙烯亚胺混合,经翅静脉注射产蛋鸡,用微球菌平板溶菌试验检测蛋清中的溶菌酶活性。结果:2个重组载体注射鸡的蛋清中均有rhLYZ的表达,pOV2LYZ的表达水平及维持时间优于pOV1LYZ。设立4个试验组,分别以不同剂量或注射次数的pOV2LYZ注射产蛋鸡,蛋清中重组酶的定量测定结果表明,1mg/2次注射组的表达效果较好,最高表达量达750μg/mL蛋清,有效表达维持7d左右,载体注射对鸡的产蛋等生理指标无明显影响。当初次载体注射鸡蛋清中的rhLYZ含量下降到注射前水平时,用同样的方法和剂量进行再次注射。结论:蛋清中的rhLYZ表达水平较初次载体注射有所提高,表达维持时间有所延长。用hLYZ特异抗体进行的Western印迹结果显示,表达在蛋清中的rhLYZ相对分子质量与天然hLYZ相同。

人输卵管细胞对精子存活的影响

目的 :研究人输卵管细胞对精子存活的影响。方法 :人精子与人输卵管细胞进行体外共培养 ,并以 Earle' s平衡盐液培养的精子作为对照。每日观察精子存活情况 ,并以伊红染色检测精子的存活率。结果 :在共培养组 ,人精子存活时间明显高于对照组 ( P<0 .0 1 )。共培养组精子在 9、2 4、48h的存活率分别为 ( 90 .82± 1 .94) %、( 71 .46± 6.1 9) %、( 46.64± 5.59) % ;高于对照组相应时间的存活率 ( 83 .55± 5.3 6) %、( 46.46± 4.59) %、( 1 8.3 6± 4.1 1 ) % ,差异显著 ( P均 <0 .0 1 )。结论 :人输卵管细胞及其培养液能延长精子的存活时间。

人输卵管特异性高分子量糖蛋白周期性分泌特性研究

在以往人输卵管抗原研究中,发现有一种与植物凝集素BS-1结合的高分子量糖蛋白,本文旨在探讨其在月经周期不同时相的分泌特性。收集育龄妇女子宫肌瘤术后月经周期不同时相的输卵管,用于制备人输卵管蛋白;采用SDS-PAGE电泳、过碘酸西夫(PAS)染色、转移印迹(West-ern Blot)以及斑点印迹(Bio-dot)等试验分析人输卵管蛋白。结果表明,这种大于300kD输卵管糖蛋白在排卵中期开始出现,排卵中后时相明显增多,排卵后期减少,并在人输卵管冲洗液和提取液中均可检测到。提示这种人输卵管高分子量糖蛋白可能由输卵管内膜上皮细胞合成和分泌,然后进入输卵管液中;并在排卵后分泌明显增多,其合成和分泌可能受性激素调控。

人血清白蛋白基因的克隆及其真核表达载体构建

利用RT-PCR扩增并克隆了含人血清白蛋白序列长约1.8 kb的片段,酶切鉴定并进行序列分析,测序结果与GenBank中登录的人血清白蛋白cDNA序列的同源性为97%;以鹌鹑卵清蛋白5’调控区POV来启动HAS的表达。用限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pOV和pHSA,然后用T4连接酶定向连接成重组质粒pOV-pHSA,经酶切鉴定,两者成功融合。

重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较

为了研究表达在蛋清中的重组人组织激肽释放酶（rhK1）是否与天然组织激肽释放酶具有相似的理化特性，对鸡输卵管暂态生物反应器表达的rhK1与猪胰腺组织激肽释放酶（pK）的理化特性进行比较鉴定．Western blotting检测结果显示，表达在蛋清中的rhK1能被人组织激肽释放酶（hK1）特异抗体识别，与pK无交叉反应，rhK1酶原和成熟酶的分子量约为43kDa和37kDa．理化鉴定结果显示，rhK1在pH7～10的范围内活性稳定，而pK在pH8～9的范围内活性较稳定；rhK1和pK均能被Cu^2＋、Fe^3＋和Al^3＋完全抑制；rhK1和pK的热稳定性相似，但rhK1在37℃孵育20min后被显著激活、以上试验结果表明，表达在蛋清中的rhK1分子量正确，理化特性与猪的天然酶相似，具有开发利用价值．

人输卵管中与植物凝集素BS-1结合糖蛋白初步鉴定

动物实验证明,排卵后卵子透明带在输卵管转运过程中被修饰。在金黄地鼠中已证实这种与透明带相关的输卵管成分是一种与植物凝集素BS-1结合的糖蛋白。本研究使用育龄妇女术后输卵管标本,并收集人输卵管冲洗液,经荧光组化、斑点印迹和转移印迹等试验证实了人输卵管中也存在与植物凝集素BS-1结合的蛋白。荧光组化法结果表明,这种糖蛋白在人输卵管中呈节段性分布,即在峡部内膜分布较多,而在伞端较少。斑点印迹试验证实,在人输卵管内膜提取液及输卵管冲洗液中均有BS-1结合蛋白存在。转移印迹试验还证实,人输卵管中与BS-1结合的蛋白分子量为80、100、130和>300 kD。以上结果提示人输卵管中确实存在与植物凝集素BS-1结合的糖蛋白。

人输卵管蛋白全长cDNA克隆及真核细胞中的表达

目的:克隆人输卵管蛋白(hOviductin)全长cDNA序列,真核细胞中表达,并了解hOviductin是否与大鼠卵母细胞结合。方法:构建人输卵管黏膜上皮细胞cDNA文库,以^(32)P标记的兔输卵管蛋白全长cDNA序列为探针,自文库中筛选hOviductin全长cDNA序列。将获得的hOviductin编码区cDNA序列插入pEGFP-N1真核表达载体,转染HeLa细胞,表达分泌重组的绿色荧光蛋白(EGFP)-hOviductin,并估量其浓度。激光扫描共聚焦显微镜下观察EGFP-hOviductin与大鼠卵巢的卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)或去除透明带后的裸卵的结合情况。结果:所构建的cDNA文库重组率为98.5％,滴度为1.1×10~6pfu/mL。克隆所得hOviductin全长cDNA约为2500 bp,Gen-Bank的登录号为AY189737。EGFP-hOviductin在条件培液中的浓度为0.236 nmol/L,能结合在去透明带的大鼠裸卵质膜外表面,而未见其与COC结合。结论:hOviductin能在HeLa细胞中表达分泌,其分泌产物可结合于大鼠裸卵质膜外表面。

胎儿输卵管上皮细胞分化观察

采用光镜和电镜技术观察了10周～38周胎儿输卵管上皮细胞特别是纤毛细胞的发育和分化。光镜下10周胎儿输卵管壶腹部管腔狭小,上皮为较原始的单层柱状上皮,12周粘膜上皮出现小的皱褶,16周～17周形成短的绒毛样突起,19周～32周渐形成较复杂的粘膜皱襞,至38周粘膜皱襞已接近成体。电镜下17周上皮中偶见单纤毛的细胞,胞质内细胞器较发达,糖原含量丰富,19周出现少量纤毛细胞,胞质细胞内器发达,可见溶酶体,此时纤毛较短,不具9×2+2微管结构,非纤毛细胞也有各种细胞器,但不含溶酶体。20周～30周纤毛细胞仍稀少,至32周以后纤毛细胞数量逐渐增多,其胞质中细胞器发达,糖原丰富,纤毛具典型的9×2+2微管结构,36周～38周可见形态分化较完好的纤毛细胞,非纤毛细胞顶端明显突向管腔,甚至落入管腔中,胞质内未见膜包的分泌颗粒。

禽腺联病毒序列对鸡输卵管细胞表达人溶菌酶基因的促进作用

将鸡卵清蛋白基因5′-调控区控制的人溶菌酶(hLYZ)cDNA表达盒插入禽AAV末端反向重复序列之间,将CMV启动子控制的rep表达盒插入其下游,获得的表达载体pRep2ITR-OV4-LYZ用聚乙烯亚胺包裹,经翅静脉注射产蛋鸡,待蛋清中rhLYZ表达水平下降至注射前水平时,用pRep2ITR-OV4-LYZ进行3次重复注射,以RBB-R染料标记比色法和Western-blotting检测蛋清中rhLYZ表达,以细菌生长抑制试验检测rhLYZ活性。结果,在相同试验条件下,pRep2ITR-OV4-LYZ表达rhLYZ的水平和时间优于不含禽AAV序列的pOV4-LYZ,rhLYZ表达水平和时间随载体注射次数增加呈上升和延长趋势,rhLYZ的分子质量与天然hLYZ相同,对致乳牛乳腺炎大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌具有显著的抑制作用。试验结果提示,禽AAV ITR和rep序列能促进hLYZ基因在鸡输卵管细胞中正确表达。

育龄期妇女输卵管结扎后上皮细胞超微结构的改变

应用扫描电镜观察9位育龄期妇女正常和结扎后的输卵管上皮。结果表明:在输卵管结扎疤痕两侧各0.5cm处,粘膜上皮细胞的纤毛大量扭曲和粘连,局部上皮纤毛和微绒毛脱落,细胞形态不规则,而在距输卵管结扎疤痕两侧各1.0cm处,上皮细胞的纤毛和微绒毛形态和结构均正常。表明输卵管结扎后上皮的超微结构变化,使卵细胞输送功能丧失,可能是输卵管复通术后不孕的重要原因。因此,施行输卵管复通术时,输卵管疤痕切除的范围应不少于疤痕两侧各0.5cm,以提高输卵管复通率。此外,发现输卵管小孔仅位于输卵管积水处粘膜的分泌细胞间,可能与输卵管浆膜下毛细淋巴管相沟通,与引流输卵管积水有关。在输卵管积水处粘膜的表面纤毛细胞的纤毛大量脱落,微绒毛增生,许多纤毛细胞转变为分泌细胞。提出了形成输卵管积水新的发病机理。

活血下胚汤辅助治疗输卵管妊娠临床观察

目的:观察活血下胚汤辅助治疗输卵管妊娠的临床疗效。方法:将90例输卵管妊娠患者随机分为联合组与西医组各45例。西医组给予腹腔镜下输卵管开窗术治疗,联合组术后辅以活血下胚汤治疗。7天为1疗程,2组均治疗2疗程。对比分析2组治疗前后血人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的变化,评估治疗效果,记录患者治疗前后输卵管通畅情况及不良反应发生情况。结果:治疗1疗程,2组血β-HCG水平均较治疗前降低(P<0.01);组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗2疗程,2组血β-HCG水平均较治疗1疗程时降低(P<0.01);联合组血β-HCG水平低于西医组(P<0.01)。联合组血β-HCG水平恢复正常所需时间短于西医组,差异有统计学意义(P<0.01)。联合组显效率77.78%,对照组显效率46.67%,2组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗后,2组患侧输卵管通畅率均较治疗前升高,差异均有统计学意义(P<0.01);联合组患侧输卵管通畅率高于西医组,差异有统计学意义(P<0.05)。2组胃肠道反应、口腔溃疡、骨髓抑制及肝功能损害发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:活血下胚汤辅助腹腔镜下输卵管开窗术治疗输卵管妊娠患者,能提高治疗效果。