昆布多糖对人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1生长信号转导的影响

目的探讨昆布多糖对人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1生长信号转导影响研究。方法选用TPC-1人乳头状甲状腺癌细胞株,分别采用相应药物进行处理。采用噻唑兰(MTT)染色法检测昆布多糖对TPC-1细胞生长的抑制作用,采用流式细胞术分析昆布多糖对TPC-1细胞凋亡及细胞周期比例的影响,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测各组TPC-1细胞促甲状腺素受体(TSHR)、磷脂酶C-β3(PLC-β3)、蛋白激酶Cα(PKCα)蛋白表达水平。结果干预24h、48h、72h后,与对照组比较,昆布多糖0.4 g/L、0.8 g/L、1.6 g/L、2.0 g/L组TPC-1细胞生长抑制率较高,且昆布多糖0.4 g/L组<0.8 g/L组<1.6 g/L组及2.0 g/L组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,昆布多糖0.4 g/L、0.8 g/L、1.6 g/L组TPC-1细胞凋亡率较高,G2/M期细胞比例较高,且昆布多糖0.4 g/L组<0.8 g/L组<1.6 g/L组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,昆布多糖0.4 g/L、0.8 g/L、1.6 g/L组TSHR、PLC-β3、PKCα蛋白表达水平较低,且昆布多糖0.4 g/L组>0.8 g/L组>1.6 g/L组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论昆布多糖能剂量依赖性抑制人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1生长,使细胞阻滞于G2期,促进细胞凋亡,其作用可能与抑制TSHR-PLC-β3-PKCα生长信号通路转导有关。

长链非编码RNA CCAT1对人乳头状甲状腺癌侵袭和迁移能力的影响

目的检测长链非编码RNA CCAT1在人乳头状甲状腺癌中的表达,并观察下调表达CCAT1对人乳头状甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法检测人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1及人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中CCAT1的水平,在TPC-1细胞中转染CCAT1 siRNA质粒,利用Transwell小室及划痕实验观察下调表达CCAT1对细胞侵袭和迁移能力的影响,通过Western blot检测BRAF、MUC15、RKIP蛋白的变化。结果人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1中CCAT1的水平明显高于人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1;在TPC-1细胞中下调表达CCAT1后能够明显抑制细胞的侵袭和迁移能力;Transwell侵袭实验和迁移实验显示下调表达CCAT1组TPC-1细胞的穿膜数与对照组比较明显减少。划痕实验中下调表达CCAT1后细胞间距较对照组明显增大,提示细胞运动能力减弱。同时下调表达CCAT1可明显降低细胞中BRAF、MUC15的表达,增高RKIP蛋白的表达。结论人乳头状甲状腺癌中长链非编码RNA CCAT1较正常甲状腺细胞明显升高;在乳头状甲状腺癌中下调表达CCAT1可抑制细胞的侵袭、迁移运动能力,并且可能通过影响BRAF、MUC15、RKIP蛋白的表达发挥上述功能。

人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1的HMGA2基因敲除模型构建

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein AT-Hook-2,HMGA2)基因的人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1细胞模型。方法重组pLV[2gRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6>{hHMGA2[gRNA#A1]*}-U6>{hHMGA2[gRNA#A2]*}慢病毒质粒载体的构建:设计靶向HMGA2基因的Dual-gRNA序列,将合成的Dual-gRNA片段克隆到pLV[2gRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6载体中,提取单克隆进行测序验证。成功构建的重组质粒载体进行慢病毒包装,并感染TPC-1细胞,利用嘌呤霉素进行筛选获得HMGA2敲除的单克隆,进行PCR及测序验证,实时荧光定量qPCR检测细胞中HMGA2 mRNA的敲除效率。结果经测序验证,成功构建了靶向HMGA2基因的pLV[2gRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6>{hHMGA2[gRNA#A1]*}-U6>{hHMGA2[gRNA#A2]*}质粒。挑取单克隆进行PCR鉴定及基因测序,成功获得了HMGA2完全敲除的TPC-1细胞。经实时荧光定量qPCR检测HMGA2敲除的TPC-1细胞,未表达HMGA2 mRNA。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术能成功构建稳定敲除HMGA2基因的人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1细胞模型。