人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的 构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法 以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果 带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论 已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。

人血纤维蛋白溶酶原K5环的基因合成、表达、纯化与活性鉴定

根据大肠杆菌遗传密码的偏爱性 ,人工合成人血纤维蛋白溶酶原 K5全基因 ,并在原核系统中以硫氧还蛋白融合蛋白的形式实现了高效表达 .重组蛋白通过 Ni2 +金属螯合层析得到初步纯化 ,通过肠激酶切割去除了融合标签 .应用鸡胚尿囊膜实验检测切割后的 rh K5的生物学活性 ,发现与对照组相比 ,rh K5能明显地降低血管管径、血管总面积以及血管总面积与视野面积的比值 ,表明切割后的产物具有显著抑制新生血管生成的生物学活性 .为进一步研究和开发抗血管生成药物奠定了基础 .

人纤溶酶原饼环区5(hPK5)基因的分泌型表达

构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )基因的原核可溶性表达载体并进行表达和纯化 ,获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白。以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增了hPK 5基因 ,经过适当酶切后构建表达载体pET2 2b( + ) hPK 5 ,转入大肠杆菌BL2 1 (DE3)进行表达并经组氨酸亲和层析获得纯化。带有重组质粒pET2 2b( + ) hPK 5的大肠杆菌经IPTG诱导后以可溶性形式表达 1 6kDa的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 30 %以上 ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有His tag抗原活性。构建了pET2 2b( + ) hPK 5重组质粒并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量hPK 5基因工程产品奠定了实验基础。

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。

人纤溶酶原半胱氨酸卷曲区5(hPK-5)基因在4种工程菌株中表达差异性研究

目的 :探索表达人纤溶酶原半胱氨酸卷曲区 5 (hPK 5 )的最佳菌株 ,为研究其抑制内皮细胞增殖和迁移的活性 ,开发肿瘤治疗和预防肿瘤转移的新药提供前提。方法 :在将人纤溶酶原半胱氨酸卷曲区 5 (hPK 5 )基因与原核表达载体pBV2 2 0进行体外重组获得表达质粒 pBV2 2 0 /hPK 5 ,采用氯化钙转化法将重组质粒分别导入BL2 1(DE3)、DH5α ,JM10 9和BL2 1(DE3) pLyss 4种工程菌 ,在温控诱导表达条件下进行相同表达条件和优化表达条件下的hPK 5因子表达差异性研究。 结果 :工程微生物 (本研究为工程菌株 )的筛选、培养条件的建立、外源基因表达条件的建立是优化基因工程技术体系的重要技术环节。结论