血小板HPA-3,HPA-15基因分型微滴式数字PCR检测体系的构建

目的建立血小板HPA-3,HPA-15基因分型的微滴式数字PCR(ddPCR)高灵敏检测方法,并初步探索应用于孕妇外周血胎儿游离DNA HPA抗原相容性检测的可行性。方法针对HPA-3,HPA-15的SNP突变位点,设计特异性引物及MGB探针,优化ddPCR退火温度及引物浓度等扩增条件,建立最佳反应体系,明确检验程序。对该检测方法进行方法学性能评估包括特异性、灵敏度、重复性和稳定性。利用ddPCR技术对2022年6月至2023年6月67例临床血液标本进行检测,将等位基因分型结果与基因测序结果比较,并对52例母体外周血胎儿游离DNA HPA抗原进行检测。结果检测血小板HPA-3,HPA-15的ddPCR方法,引物及探针特异性良好,HPA-3,HPA-15的最佳退火温度分别为:61.6℃,60.2℃;体系最佳引物浓度分别为:900 nM,700 nM;探针终浓度均为250 nM。拷贝数定量检测范围为:2~20000 copies,检测下限为0.1 copies/μL且线性良好。在低拷贝数标本中,HPA-3及HPA-15实际检测值的批内及批间变异系数(CV)均<5%。对67份人血液标本DNA的HPA-3,HPA-15基因型检测,结果与基因测序结果完全一致。应用于胎母血小板HPA-3,HPA-15基因型检测结果符合预期。结论本研究构建的HPA-3,HPA-15 ddPCR检测体系准确性高,重复性及稳定性较好,灵敏度高,可应用于临床血小板HPA-3,HPA-15基因型供者库的建立、基因配型及胎母血小板相容性检测等。

基于序列的多重聚合酶链反应对献血者HLA/HPA基因分型

目的研究嘉兴地区献血者HLA-I类(A、B位点)和HPA基因表达情况,建立本地区血小板基因数据库。方法采用基于序列的多重聚合酶链反应(multiplex PCR-SBT)对嘉兴地区5,411例样本进行HLA-I类(A、B)基因测序,对其中199例单采血小板献血者样本进行HPA1-6、15、21w系统基因分型,统计分析HLA-I类和HPA1-6、15、21w基因频率分布情况。结果5,411例样本中共检出HLA-A、B位点等位基因53种,其中HLA-A位点等位基因15个,频率前5位为A*2(0.3040)、A*11(0.2384)、A*24(0.1771)、A*33(0.0893)、A*30(0.0493);HLA-B位点等位基因38个,频率前5位为B*46(0.1137)、B*60(0.1136)、B*13(0.0931)、B*62(0.0822)和B*58(0.0820)。HPA1~6、15、21w系统均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,具有恒定性,以HPA-3杂合度(a/b杂合子基因型)最高(0.482),其次为HPA-15(0.437),HPA-3、15系统中a、b抗原频率相近,HPA-3、15系统有b/b纯合子基因型,分别为0.196,0.266。其余5个系统均以a/a纯合子基因型为主,分别为0.995、0.8995、0.990、0.975、0.945,未见b/b基因型。结论HLA-A、B位点和HPA3、15系统基因具有多态性分布特点,建立献血者HLA/HPA基因数据库可有效解决血小板输注无效问题。

为提升IPTR患者血小板输注后CCI值建立分级规避HLA抗体对应抗原方法及HLAMatchmaker的应用研究

目的:建立分级规避HLA抗体MFI阈值对应抗原方法,联合应用HLAMatchmaker表位计算法,选择供患者表位最小错配评分值,评估两种方法为免疫性血小板输注无效(Immune platelet transfusion refractoriness,IPTR)患者选择HLA相容性血小板供者,在提升血小板输注后校正增加值(CCI)的应用价值。方法:采用SPRCA法完成51例IPTR患者的7807次血小板交叉配型实验,判断其免疫反应阴/阳性结果。采用Luminex单抗原流式微珠法检测患者的HLA-I类抗体,获得不同特异性抗体对应HLA-I类抗原MFI值,并将其分组及分级,强阳性组(MFI>4000,1级)、中阳性组(1000中阳性组>弱阳性组)。强阳性和中阳性组与阴性对照组之间的SPRCA实验免疫反应阳性结果检出数存在统计学差异(P<0.001),弱阳性位组和阴性对照组之间的SPRCA实验免疫反应阳性结果检出数无统计学差异(P>0.05)。设置强阳性组为相应特异性HLA位点对应抗原1级规避阈值,中阳性组为2级规避阈值,弱阳性组为3级规避阈值,在供者血小板紧缺情况下,可以不需要规避弱阳性组。规避1和2级HLA-I类抗体对应供者抗原及选择HLAMatchmaker表位错配评分数≤7血小板供者策略,24 h内CCI值均>4.5×109/L,均可获得临床血小板输注有效。结论:在为IPTR患者选择HLA-I类相容性供者时,分级规避HLA-I类抗体对应供者抗原,综合选择供受者HLAMatchmaker表位错配评分数≤7,经血小板交叉配型实验确认为阴性结果的供者选择策略,对提升IPTR患者血小板计数具有一定实际应用价值。

中国汉族人群人类血小板抗原HPA-15(Gov)多态性调查

目的研究中国汉族人群人类血小板抗原HPA15(Gov)系统多态性,评估其在血小板配型输注中的作用。方法采用PCRSSP技术对1000名来自不同省份汉族无关献血者进行HPA15系统基因分型。结果HPA15在所调查的7个省份汉族人群中的分布差异无显著性意义,在1000名汉族中HPA15a和15b基因频率分别为0.5320和0.4680,与HardyWeinberg平衡吻合;与其它种族的HPA15分布相比较,也无显著性差异。在随机输血中HPA15a和15b抗原不配合的机会分别为0.1711和0.2029。结论本调查数据表明,随机输血中供受者HPA15抗原不配合比例在中国汉族人群中高达37%,这对研究同种免疫血小板减少症和开展血小板同型输注具有指导意义。

广州地区无偿献血者HPA-1—6,15基因分型及频率调查

目的研究人类血小板基因多态性,为人类群体遗传学研究及临床输血实践提供重要数据和依据。方法通过PCR-SSP方法对广州地区706名无偿献血者的HPA1—6,15系统进行基因分型,并统计其频率。结果706份样本中HPA-3和-15基因型的杂合程度最高,其a/a、a/b、b/b的频率分别为HPA-3:0.2918、0.4830、0.2252;HPA-15:0.2691、0.5170、0.2139,不配合率较高,均达到35%以上。HPA-1、-2、-4、-5系统均以a/a纯合子为主,a基因的频率范围为0.9583—0.9993,且均未发现b/b纯合子。1b、4b的基因频率很低,分别为0.0028和0.0007。本地区的HPA-1a与中国北方、英国白人、美国黑人有统计学差异(P<0.05)。HPA-2与中国南方、北方、美国黑人和日本人有统计学差异(P<0.05);HPA-5与英国白人和美国黑人存在统计学差异(P<0.05)。HPA-6频率分别为0.9575,0.0397,0.0028。结论本研究对广州地区HPA献血员的筛查可为建立HPA供者库和对探讨由HPA引起的免疫性疾病的预防和治疗提供相关数据和研究手段。

人类血小板抗原HPA-15系统PCR-SSP基因分型技术的建立

本研究目的是采用PCR-SSP技术建立人类血小板抗原HPA-15系统的基因分型方法,并应用于血小板供者库的HPA基因定型。采用第11届国际输血协会(ISBT)血小板血清学与基因分型协作组推荐的序列特异性引物,调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-15系统基因分型技术。该分型技术的准确性和可靠性,采用第11届ISBT血小板协作组提供的质控样本进行验证,同时采用本研究合成的引物及商品化试剂盒,对50名随机的汉族血小板捐献者进行HPA-15系统基因分型,作为平行对照。应用本研究的方法,对第11届ISBT送检的10份考核样本进行基因分型。结果表明:基因分型结果与ISBT公布的结果完全一致。50名随机的血小板志愿捐献者,经本研究的方法及美国G&T公司的试剂检测,基因分型的结果相符合;观察到的基因频率:HPA-15a和-15b分别为0.5100和0.4900。结论:本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景。

免疫性血小板输注无效患者HLA和/或HPA抗体产生的影响因素分析

目的回顾性分析影响免疫性血小板输注无效(PTR)患者HLA和/或HPA抗体产生的独立危险因素。方法收集910例PTR患者的临床资料及其HLA和/或HPA抗体检测结果,分析性别、年龄、血型、所患疾病以及输血次数、PTR发生前的血象、凝血指标等对抗体产生的影响。结果女性及有妊娠史的患者更容易产生HLA和/或HPA抗体。抗体阳性患者的平均年龄明显高于阴性患者(51.46±18.49岁vs.40.68±20.08岁,P<0.001),其平均输血次数却明显低于阴性患者(13.13±18.64次vs.18.66±22.52次,P=0.024),抗体发生率与输血次数无相关性,抗体阳性患者检测前血小板计数值(13.13±18.64×10^(9)/L vs.18.66±22.52×10^(9)/L,P=0.021)和血红蛋白含量(72.41±18.64 g/L vs.78.61±21.66 g/L,P=0.009)也明显低于阴性患者。60岁以上、女性、患有MDS、输血次数、血小板计数值都是抗体产生的独立危险因素。结论了解HLA和/或HPA抗体产生的危险因素有助于临床医生在治疗过程中采取适当措施避免PTR的发生,改善血小板输注的疗效。

献血者血小板1-16抗原基因遗传多态性分析及已知HPA型供者数据库的建立

本研究的目的是分析人类血小板抗原(humanplateletantigen,HPA)基因多态性,根据分布频率来判断HPA抗原不配合比率以及抗体产生的机会,确定有临床意义的血小板抗原系统,并建立邯郸地区血小板基因频率数据库和供者库。采用SSPPCR方法对邯郸地区148名随机献血者进行HPA116抗原32个等位基因的检测分析,并与不同人群的分布频率进行比较。结果表明:每个样本均检测到HPA1a、2a、4a14a、16a基因;HPA4a、7a14a、16a呈现单态性,未检测出相应的等位基因HPAb;对于HPA1、2、5、6主要以a/a纯合子为多,a/a基因型频率分别是0.9595、0.8108、0.9865、0.9797,没有b/b纯合子出现。在HPA116中,具有最高杂合度的是HPA15,基因型HPA15a/15a、HPA15a/15b、HPA15b/15b频率分别是0.2230、0.5270、0.2500;HPA3在其次,基因型HPA3a/3a、HPA3a/3b、HPA3b/3b频率分别是0.3851、0.5135、0.1014。经χ2检验,结果符合HardyWeinberg遗传平衡定律。邯郸地区随机献血者HPA15系统基因频率与石家庄地区相似(P>0.05);与我国台湾人群进行HPA113、HPA15的比较,HPA1、2、6具有明显的不同(P<0.05),其它相似(P>0.05);与韩国人群进行HPA18的比较,除HPA3具有明显不同外(P<0.05),其余均相似(P>0.05);与美国黑人进行HPA15的比较,HPA1、2、5具有明显的差异(P<0.05);与英国人进行HPA111的比较,HPA1、5具有明显的不同(P<0.05)。结论:北方地区中国人群HPA2、3、5、15系统具有多态性,且HPA抗原分布不配合比率较高,这必然造成免疫暴露的机会增加,提示在临床上可能具有重要的免疫学意义。同时,在此次研究数据的基础上建立了邯郸地区血小板基因频率数据库和血小板已知型供者库。

急性白血病患者HPA-1～6,15基因多态性与血小板输注疗效的相关性研究

目的通过检测人类血小板抗原1～6,15系统(Human platelet alloantigen,HPA-1～6,15),探讨HPA多态性与血小板输注疗效的相关性。方法 (1)收集30例输注2次以上血小板的急性白血病患者外周血标本,根据血小板回收率(Percentage platelet recovery,PPR)判定输注效果;(2)采用酚/氯仿方法提取DNA;(3)采用聚合酶链反应-序列特异性引物(Polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)方法在相同条件下对血小板抗原HPA-1～6,15进行基因分型,分析HPA抗原与血小板输注疗效的关系。结果 (1)HPA-1～3、HPA-5～6、HPA-15系统等位基因呈多态性分布;HPA-4呈aa纯合子单态性分布,HPA-1、5、6基因以aa纯合子为主,仅HPA-3、15见bb纯合子,b等位基因频率以HPA-2最高(0.65),其次依次为HPA-15(0.349),HPA-3(0.3)。(2)30例急性白血病患者中有21例血小板输注无效,无效率为70%,多集中于输注3次及以上组。结论 (1)抗-HPA引起血小板输注无效概率较小,主要发生在HPA-2、3、15系统,对需作HPA配型的患者只要针对此3个系统进行检测,就可提高输注效果。(2)临床应注重血小板输注治疗的个体化,减少输注次数,提高输注疗效。

SSP法和测序法对广州汉族人群HPA-6多态性调查

目的:调查广州汉族人群HPA-6多态性。方法:采用SSP法和测序法对200例广州汉族无偿血小板献血员进行HPA-6基因分型。结果:HPA-6a和-6b的基因频率分别为0.9775和0.0225,符合Hardy-Weinberg平衡。与中国其他地区人群及亚洲其他地区人群比较差异无显著性,但和其他洲人群分布存在统计学差异;在随机输血中HPA-6抗原不配合的机会为0.0430。结论:获得广州汉族人群HPA-6频率数据,对建立本地血小板供者库和开展血小板同型输注具有指导意义。

陕西地区血小板HLA/HPA基因供者库的建库评估及应用策略

目的探讨陕西地区血小板HLA/HPA基因供者库合适的库容水平及匹配概率,为本地区血小板供者库的建设、维护及应用提供数据支持。方法以11755名中华骨髓库陕西分库造血干细胞志愿捐献者、401名和249名陕西地区无血缘关系多次单采血小板捐献者为对象,分别进行HLA基因多态性分析、HPA基因分型和CD36抗原检测,应用Arlequin 3.5.2.2软件计算HLA、HPA基因频率及单体型频率,并根据表型频率计算找到HLA、HPA全匹配供者概率,评估库容水平。结果获得了陕西地区HLA-A、-B及HPA1-6、10、15、21表型群体多态性资料,在249例健康捐献者中检测到CD36抗原Ⅰ型和Ⅱ型缺失频率均为0.40%(1/249);计算推导得到当血小板供者库库容为194人时,患者有95%的把握能在该库中找到至少1名HPA1-6、10、15、21全匹配供者;1个1500人的血小板供者库有95%的概率可以找到1名HLA-A-B表型频率>0.002或单体型频率>0.001的相同供者,而找到任何1个交叉反应组(CREG)匹配的供者概率应在44.95%~97.57%之间;当供者数为8856、15033时,患者找到1名HLA表型相同的供者的概率可提高至80%和90%。结论在可靠的群体性多态性资料的支撑下,不同地区人群HLA/HPA的分布差异使得各地血小板供者库的建库模式和最适库容不尽相同,有必要应用多种血小板配合型输注策略扩大供者选择范围,从而有效降低建库成本和资源需求。

南京地区血小板捐献者HPA-1-29bw基因分型检测

目的了解南京地区汉族血小板捐献人群血小板抗原1~29(HPA-1-29bw)等位基因频率,为患者相容性血小板输注提供依据。方法采用一代测序法(Sanger测序法)对2019年2月~2019年9月在本中心捐献血小板的900名南京汉族固定捐献者做HPA基因分型,并采用直接计数法计算等位基因频率和基因型频率等。结果本组900名汉族单采血小板捐献者HPA等位基因频率分别为:HPA-1a 0.995 0、1b 0.005 0,2a 0.9467、2b 0.053 3,3a 0.585 0、3b 0.415 0,4a 0.998 9、4b 0.001 1,5a 0.982 2、5b 0.017 8,6a 0.982 8、6b 0.017 2,11a 0.999 4、11b 0.000 6,15a 0.531 7、15b 0.468 3,21a 0.992 8、21b 0.007 2;HPA-7-10w、-12-14w、-16-20w和-22-29bw均只检出单一a等位基因;本组中HPA-15不配合率最高[37.40%(337/900)],其次为HPA-3[36.77%(331/900)],另外在HPA-11w中检出1例杂合子。结论南京地区汉族血小板捐献人群HPA等位基因频率特点是HPA-15和HPA-3为最常见的杂合子,在本地临床输注中须引起重视。

血站单采血小板献血者HLA和HPA基因型数据库的调查和分析

目的 调查分析国内血站系统单采血小板献血者HLA和HPA基因型数据库情况,以促进其建库发展和应用。方法 制定调查表并经专业人员审定,培训调查人员后依据实际情况填写表单,然后收集数据进行分析。结果 调查的24个血站中,有18个建立了血小板献血者HLA和HPA基因型数据库,合计有25 240人;2017年HLA或HPA基因型配合应用总共为137例。有5个血站建立了CD36抗原阴性筛查数据库。入库标本进行了HLA-A,-B位点检测,而HPA系统检测范围不同血站存在差异,其中9个血站只检测HPA 1-6, 15, 21w系统。13个血站采用聚合酶链反应核苷酸特异性引物技术检测HPA系统基因型。13个血站开展HPA抗体检测,6个血站开展CD36抗体检测。结论 血站已建立一定规模的单采血小板献血者HLA和HPA基因型数据库,但其应用存在明显不足。

河南汉族人群血小板抗原HPA1-16bw基因多态性研究

目的研究河南地区汉族人群血小板抗原基因分布频率,建立地区性血小板抗原基因库,为血小板配合输注提供实验依据。方法用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)对160例无血缘关系的河南汉族体检健康者进行HPA1-16bw系统基因分型。结果 HPA1-6和HPA-15基因频率分别为1a 0.987 5,1b 0.012 5;2a 0.946 9,2b 0.053 1;3a 0.590 6,3b0.409 4;4a 0.996 9,4b 0.003 1;5a 0.990 6,5b 0.009 4;6a 0.981 2,6b 0.018 8;15a 0.540 6,15b 0.459 4。HPA7-14bw,16bw仅检测到a/a等位基因,基因频率均为1.000 0。经χ2检验各系统HPA符合Hardy-Weinberg平衡法则。HPA基因分布存在种族和地区差异。结论河南汉族人HPA-15和HPA-3基因型杂合率最高。HPA基因分型有助于输注血小板时降低免疫性血小板减少症的发生概率。

乌鲁木齐地区无偿献血者HPA1~17基因多态性分析

目的分析乌鲁木齐地区献血者HPA1~17基因多态性。方法采用PCR-SSP方法对605名无血缘关系的无偿献血者进行HPA1~17系统基因分型,计算基因频率与基因型频率,并与不同人群进行比较分析。结果每份标本均表达出HPA-a基因的1a^17a基因;仅表达HPA-b基因中的1b^6b和15b;HPA7a^14a、16a、17a呈单态性;对于HPA-1、-2、-4、-5、-6主要以aa纯合子表达为多;在HPA1~17中,具有最高杂合度的是HPA-15,基因型HPA15a/15a、HPA15a/15b、HPA15b/15b频率分别是0.2760、0.5438、0.1802,其次是HPA-3,基因型HPA3a/3a、HPA3a/3b、HPA3b/3b频率分别是0.3471、0.4760、0.1769。经χ2检验,结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。结论乌鲁木齐地区HPA基因分布具有自身特点,其中HPA-15和HPA-3抗原不配合率较高。同时在此次研究数据的基础上建立了乌鲁木齐地区已知HPA基因型血小板供者数据库。