血小板裂解物在再生医学和细胞治疗领域的研究进展

血小板裂解物(human platelet lysate,HPL)是1种具有促进组织修复、细胞增殖、炎症控制等多种功能的新型生物材料。我们介绍了血小板裂解物在再生医学和细胞治疗领域的发展,对其应用形式进行了分类概述,并以血小板裂解物促进细胞增殖的潜力为切入点,分析了其作为细胞培养基补充剂的优势所在。鉴于目前尚无血小板裂解物制备的标准程序,我们通过对原材料来源、供体变异性、制备工艺等标准化要素的梳理,以期为未来我国学界建立相关行业标准提供参考。

人血小板裂解液替代胎牛血清促进骨髓间质干细胞的增殖

目的探讨人血小板裂解液(human platelet lysates,HPL)对骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖以及生物学特性的影响。方法通过对机采血小板反复冻融获得HPL,采用密度梯度离心法从骨髓中分离MSCs,分别用10%胎牛血清(feotal calf serum,FCS)和LD-DMEM添加不同浓度的HPL进行培养,以确定最佳HPL浓度。分离6株人源MSCs,从原代开始分别用添加胎牛血清和最佳HPL浓度的LD-DMEM进行培养,对两种培养体系下6株不同来源的MSCs的增殖能力,表面标记表达量以及细胞周期进行研究,并利用t-test进行统计学分析,P<0.05视为有统计学差异。结果研究发现HPL中含有MSCs生长所必需的4种生长因子,PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB),bFGF(成纤维细胞生长因子),IGF-1(胰岛素样生长因子1),TGF-β1(转化生长因子β1),浓度分别为:(0.53±0.06)ng/ml,(37.5±4.31)pg/ml,(0.15±0.06)mg/ml,(5150±463)pg/ml。适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%。两种培养条件下的细胞形态无明显区别,均为长梭形。8代以前,细胞增殖能力没有显著性差异(P>0.05),两种培养条件下的MSCs均表达CD105,CD106以及粘附分子CD29和CD44,不表达CD34,CD45,且其表达量没有显著性差异(P>0.05)。两种培养体系下绝大多数细胞处于G0-G1期,FCS培养的MSCs其G0-G1期占(96.97±0.95)%,7.5%的HPL培养的MSCs其G0-G1期占(94.58±1.56)%,两种培养条件下不同周期没有显著性差异(P>0.05)。结论本研究适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%,HPL可以替代胎牛血清体外培养扩增人骨髓间质干细胞,并保持其生物学特性基本不变。

人血小板裂解液对骨髓间质干细胞成骨成脂分化的影响

目的探讨人血小板裂解液(HPL)体外培养人骨髓间质干细胞(MSCs)及其对MSCs成骨和成脂分化能力的影响。方法采用贴壁法分离培养3株人骨髓来源MSCs,每株细胞在培养时平行分为2个实验组,分别用含10%胎牛血清的低糖培养基和含7.5%HPL的低糖培养基培养,均培养MSCs至第5代,分别用成骨及成脂诱导液对每组MSCs做成骨、成脂分化诱导,诱导成功后分别用茜素红、油红O对成骨和成脂分化结果染色鉴定,并进一步对成骨、成脂诱导结果做定量分析:成骨分化染色后洗脱茜素红在562nm波长下测定OD值并对每个培养孔细胞做蛋白定量,以茜素红OD值与蛋白定量值的比值作为成骨分化的定量值;成脂分化染色后用异丙醇洗脱油红O,在510nm波长下测定OD值,以之作为成脂分化的定量值。对所得的结果做统计学分析。结果对第5代的MSCs做成骨诱导12d后,光镜下可见致密结节形成,茜素红染色及定量鉴定结果显示2种培养液培养的MSCs均能成功向成骨细胞分化,而7.5%HPL培养的MSCs成骨能力比10%FBS培养的MSCs强,定量鉴定结果分别为16.548±4.397、4.151±5.631(P<0.05)。成脂诱导12d后,细胞内有明显脂滴形成,油红O染色及定量分析结果显示MSCs成功向脂肪细胞分化,但7.5%HPL培养的MSCs成脂能力与10%FBS培养的MSCs相比较弱,定量鉴定结果分别为0.239±0.030、0.497±0.105(P<0.05)。结论 HPL可以促进MSCs成骨分化,抑制其成脂分化。

血小板裂解液快速扩增人羊膜来源间充质干细胞

目的:研究人血小板裂解液(HPL)扩增的羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)的细胞生物学特征。方法:分别以含7%HPL和10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养介质扩增人AMMSCs,比较含HPL和FBS介质培养扩增的AMMSCs的形态、扩增效率、免疫表型和多向分化潜能。结果:含HPL和FBS培养介质扩增的AMMSCs形态和免疫表型类似。含HPL培养介质能显著加速间充质干细胞(MSCs)的扩增,扩增的AMMSCs能向成骨、软骨和脂肪细胞分化。结论:含HPL培养介质可促进AMMSCs扩增,可为相关临床治疗提供更多人源化、无伦理争议、临床应用障碍少的MSCs。

混合血小板裂解液对人骨髓间充质干细胞原代培养、增殖和成骨分化的影响

目的研究混合血小板裂解液(pHPL)对体外培养的人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)原代培养、增殖和成骨分化的影响。方法使用临床过期的多份浓缩血小板混合,多次冻融激活后制备pHPL,分别使用胎牛血清(FBS)和pHPL加基础培养液原代培养hBMMSCs,比较两组中的细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期和增殖率,并在加入经典成骨诱导液后检测两组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量和矿化结节形成,比较其成骨分化能力。结果FBS和pHPL培养组均能较好地支持hBMMSCs的原代培养,两组中细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期均无明显差异,但pHPL组在5、7d时的细胞增殖率明显高于FBS组(P<0.05);在成骨诱导后,pHPL组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量也明显高于FBS组(P<0.05),两组中细胞均可以形成成熟的矿化结节。结论pHPL能够很好支持hBMMSCs的原代培养、增殖和成骨分化,且较FBS能更好地促进其增殖和成骨分化。

两种体外培养体系对人骨髓间充质干细胞原代培养、增殖和成骨分化的影响比较

目的研究使用混合血小板裂解液(pHPL)和StemPro^■ MSC无血清培养体系对人骨髓间充质干细胞原代培养、增殖和成骨分化的影响。方法分别使用异体浓缩血小板制备的混合血小板裂解液pHPL和StemPro^■ MSC无血清培养体系原代培养人骨髓间充质干细胞,以经典的胎牛血清培养方案做对照,比较3组中的细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期和增殖率,并在加入经典成骨诱导液后检测3组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量和矿化结节形成,比较其成骨分化能力。结果pHPL、StemPro^■ MSC和FBS培养组均能较好支持人骨髓间充质干细胞的原代培养,3组中细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期均无明显差异,pHPL和StemPro^■ MSC组中细胞增殖率无明显差异,但均明显较FBS组高。在进行成骨诱导后,pHPL组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量均较StemPro^■ MSC组和FBS组高,3组中均能见到成熟的矿化结节形成。结论pHPL和StemPro^■ MSC均能够很好地支持人骨髓间充质干细胞的原代培养,并且促进细胞增殖的能力均较FBS为高,而且pHPL在促进其成骨分化方面较StemPro^■ MSC和FBS更强。

人血小板裂解液促进人羊膜来源间充质干细胞的成骨分化

目的:研究人血小板裂解液(HPL)对羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)成骨分化的作用。方法:分别以含7%HPL(HPL组)和10%胎牛血清(FBS,FBS组)的LG-DMEM培养介质扩增AMMSCs,比较两组扩增AMMSCs效率及其免疫表型SSEA-3和SSEA-4的表达差异。使用MSCs成骨分化培养液诱导AMMSCs成骨,对比观察两组钙盐沉积量、钙化结节、碱性磷酸酶(ALP)活性;提取两组成骨诱导后AMMSCs总RNA,采用RTPCR检测成骨分化调节因子RUNX-2和ALP mRNA相对表达量。结果:HPL组扩增速度快于FBS组;AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4表达较FBS组明显下调(P<0.05)。HPL组钙盐沉积量、钙化结节数量、ALP活性以及RUNX-2和ALP mRNA表达量均明显高于FBS组(P均<0.05)。结论:含HPL培养介质可促进AMMSCs成骨分化。

免疫缺陷小鼠体内人源化骨髓微环境的重建

目的:通过在免疫缺陷小鼠体内重建人源的骨髓微环境,为进一步研究人异常的骨髓微环境在人白血病发生发展中的作用提供模型。方法:通过反复冻融浓缩后血小板获得人血小板裂解液(HPL),以α-MEM作为基础培养液分别添加10%HPL和10%胎牛血清(FBS)培养骨髓来源的间充质干细胞。比较两种添加成分对MSC形态、免疫表型、多向分化能力以及增殖能力的影响;将HPL培养的MSC接种于β-TCP支架材料并移植到免疫缺陷小鼠背部皮下,8-12周后取出移植体做HE染色,观察MSC在体内形成骨以及骨髓结构的能力。结果:用HPL和FBS培养的M SC均呈现长梭形纤维样细胞结构,均具有多向分化能力;两种体系培养的M SC免疫表型无明显区别,但用人血小板裂解液培养的MSC具有更强的增殖能力和向成骨分化能力;用人血小板裂解液培养的MSC具有在体内形成骨组织样结构的能力。结论:HPL培养的MSC具有更强的增殖能力以及成骨分化潜能,它能在NOD/SCID鼠上重建人源化骨髓微环境。

单个细胞来源胎盘间充质干细胞培养方法的比较研究

目的·观察胚胎来源间充质干细胞(placental derived mesenchymal stem cells,PMSCs)在人血小板裂解液(human platelet lysate,HPL)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)及传统的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)不同组合的培养基中的倍增数目及细胞性状,着重探索更合适的PMSCs培养体系。方法·分离单个细胞来源PMSCs,扩增后分别用 4 种培养基孵育,分为FBS 组、FBS+b FGF组、HPL组以及HPL+b FGF组。观察细胞形态及生长状态、细胞表型及多能分化。在P1、P2、P3、P4代进行计数。取P4代细胞接种,分析集落形成单位的个数。结果·经鉴定,PMSCs具有间充质干细胞的生物特性。数量上,FBS+b FGF组在P4代达到(1.12×10~7)个/cm^2,HPL组达到(1.24×10~7)个/cm^2(P>0.05),而FBS组和HPL+b FGF组则只有(5.58×10~6)个/cm^2和(8.56×10~6)个/cm^2。细胞形态上,FBS+b FGF组与HPL组 P4代的 PMSCs均保持贴壁生长,但HPL组细胞于P5代无法贴壁生长。细胞集落数量上,P4代时,FBS+b FGF组为51个/ 孔,HPL为52个/ 孔(P>0.05)。细胞生物学特性上,FBS+b FGF 组和HPL组在P4代时均能基本保有间充质干细胞的特性和多能分化的能力。结论·从细胞数量上来看,HPL组中的P4代细胞数与目前常用的FBS+b FGF培养基没有显著差异,且已达到临床治疗剂量需求;从细胞生物学特性上来看,HPL培养基与FBS+b FGF培养基均能基本保持PMSCs细胞特性和多能分化的能力。但由于HPL培养基免疫原性低,因此更适合临床移植应用。然而,由于HPL培养基无法维持PMSCs生长至5代以后,故无法用于大规模细胞扩增。HPL+b FGF在目前实验条件下并不具备优势。

生物材料人血小板裂解液在组织再生修复中的应用与作用

背景:人血小板裂解液富含多种可促进组织损伤修复的物质,是一类可促进组织细胞再生修复的生物材料。目的:总结人血小板裂解液的组成、制备工艺及其近年来在人组织修复中的临床研究与应用进展。方法:第一作者以“human platelet lysate,clinical,trial,regeneration,tissue repair,wound healing,biomaterial”为英文检索词,以“血小板裂解液,临床,临床试验,再生,组织修复,创伤愈合,生物材料”为中文检索词,应用计算机检索PubMed、clinicaltrials.gov、中国临床试验注册中心、维普、万方及知网数据库中2013年1月至2021年3月已发表的相关文献。结果与结论:人血小板裂解液可以从自体外周血、异体外周血或脐血中制备,富含多种促进细胞生长和创伤修复相关生物活性物质。目前发表的临床研究结果表明,单独使用人血小板裂解液或者人血小板裂解液联合细胞治疗在组织修复中均具有安全性和有效性。22项正在进行的临床研究涉及到包括新冠肺炎造成的呼吸窘迫综合征、下肢血管疾病、糖尿病溃疡、面部美容等新的适应证,未来这些临床研究有效性结果将进一步增加人血小板裂解液在组织再生修复中的作用。将人血小板裂解液与组织工程材料相结合,将为其在更大组织缺损的再生修复奠定基础。

结合人血小板裂解液培养人脐带间充质干细胞的基础培养基选择

目的结合人血小板裂解液(platelet lysate,PL)选取一种安全性高、成本低、适用于人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)生长,且在培养过程中不影响细胞各项功能的基础培养基,用于大量高代次hUC-MSC的培养。方法将MSCBM、α-MEM、IMDM 3种基础培养基分别与PL UltraGROG Advanced进行配比,培养P0~P8代hUC-MSCs,对比不同代次的细胞形态、扩增数量、增殖功能、分化功能及免疫表型,确定适用于HUC-MSCs培养的最佳基础培养基。结果3种培养基培养的P1~P5代细胞,形态均一,呈放射状生长,与标准的细胞形态相比差异无统计学意义(t_(IMDM VSα-MEM)=0.159,t_(MSCBM VSα-MEM)=0.147,t_(IMDM VS MSCBM)=0.161;P均>0.05),培养至P6~P8代时,MSCBM、α-MEM培养的细胞与P0~P5代细胞形态相比,差异无统计学意义(t_(IMDM VS MSCBM)=0.132,t_(IMDM VSα-MEM)=0.128;P均>0.05);MSCBM、α-MEM、IMDM培养的P1~P8代细胞阳性表达CD73、CD90、CD105,表达率均约达99%,阴性表达CD34、CD45,表达率均低于2%,不同培养基间差异无统计学意义(t_(IMDM VSα-MEM)=0.102,t_(MSCBM VSα-MEM)=0.106,t_(IMDM VS MSCBM)=0.113;P均>0.05);3种培养基培养的P8代细胞克隆形成性不同,MSCBM培养的细胞形成的单个克隆团和克隆团内细胞数量均高于α-MEM、IMDM培养的同代次细胞(t分别为0.023、0.049,P均<0.05);3种培养基培养的细胞增殖功能由高到低分别为MSCBM、α-MEM、IMDM,其中MSCBM显著高于IMDM(t=0.041,P<0.05),而与α-MEM差异无统计学意义(t=0.211,P>0.05),倍增时间(DT)与增殖功能结果一致;3种培养基培养的同代次细胞均具有较强分化功能,培养的P8代细胞分化成骨和成软骨的细胞数量无显著差异(t_(IMDM VSα-MEM=0.119,t_(MSCBM VSα-MEM)=0.112,t_(IMDM VS MSCBM)=0.111;P均>0.05),MSCBM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于α-MEM培养的P8代细胞(t=0.036,P<0.05),α-MEM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于IMDM培养的P8代细胞(t=0.031,P<0.05)。结论确定了最佳hUC-MSCs培养体系为MSMBM添加5%UltraGROG Advanced,其次为α-MEM添加5%UltraGROG Advanced,建议选择此两种无血清培养体系用于MSCs的大规模培养。

血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的探讨血小板裂解液(platelet lysate,PL)在体外定向诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)分化成软骨细胞中的作用。方法取健康产妇自愿捐赠脐带,采用胶原酶消化法分离hUCMSCs,体外培养扩增,流式细胞仪进行细胞表型鉴定。根据加入诱导培养基成分不同将实验分为以下3组:A组为H-DMEM培养基、10%FBS及10%PL,B组为H-DMEM培养基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50μg/mL维生素C及1%胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferrin-selenium,ITS),C组为H-DMEM培养基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、1%ITS及10%PL。诱导培养2周,甲苯胺蓝染色检测各组软骨细胞基质的分泌,免疫荧光检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,半定量RT-PCR检测蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原表达。结果分离得到的hUCMSCs不表达造血细胞的表面标记CD45、CD34和HLA-DR,而表达黏附分子和MSCs表面标记CD44、CD105和CD146。甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色示C组呈阳性,B组呈弱阳性,而A组均呈阴性。半定量RT-PCR检测示Aggrecan和Ⅱ型胶原在B、C组中均有表达,A组中未见表达;C组Aggrecan mRNA和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论单纯10%PL不能诱导hUCMSCs成软骨分化,但它可当作成软骨诱导培养基的辅助添加剂,对hUCMSCs成软骨分化有明显促进作用,为构建组织工程软骨提供了新的可利用条件。

血小板裂解液替代胎牛血清培养间充质干细胞

目的观察人血小板裂解液（HPL）对脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的形态、增殖、表面标志、诱导分化能力的影响。方法取正常足月妊娠产妇脐带血，离心后收集血沉棕黄层及血清按4：1混合后-20℃冻存，反复冻融2次后制成HPL，按10％比例加入培养基。分离获得UC-MSCs，在含10％HPL或10％胎牛血清（FBS）的培养基中培养，比较培养30d所获得的累积倍增级、最大传代代数所获得的细胞数及第3代细胞6孔板中培养6d所获得的细胞量；通过流式细胞仪检测HPL对培养细胞的表面标志的影响；观察HPL对培养细胞的成骨、成脂及成软骨诱导分化能力的影响。结果HPL或FBS培养的UC-MSCs形态相同，均为长梭形，传至第3代形态无明显改变。在HPL或FBS中培养30d所获得的累积倍增级比较差异无统计学意义（P〉0．05）；HPL培养的细胞在第10代的细胞量[（7．5±0．4）X10^6个]明显多于10％FBS组[（4．34±0．2）×10^6个]；第3代UC-MSCs在6孔板培养6d后，HPL组所得细胞数明显多于FBS组（P〈0．05）。流式结果显示，UC-MSCs表面高表达CD44、CD73、CD90、CD105，不表达或低表达CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45及人类白细胞抗原DR基因（HLA-DR）。与10％FBS培养的UC—MSCs比较，10％HPL培养并未影响其表面标记的表达。HPL或FBS培养的UC-MSCs均能进行三系诱导分化，其分化能力无明显差异。结论HPL可以代替FBS来进行培养和扩增UC-MSCs。在保持其形态、表面标志、分化能力不变的情况下，UC-MSCs在HPL环境下增殖更快。