人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、RTPCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,LEK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的LEK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P<0.01)。IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPEmRNA表达水平和培养上清液中LEK的分泌量明显增高(P<0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P>0.05)。结论成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。

可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建

目的:构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株(IAST).方法:应用分子克隆技术构建含人前脑啡肽原基因(hPPE)的逆转录病毒四环素反应质粒(pRe-vTRE/hPPE);以脂质体转染法将重组质粒pRevTRE/hPPE和调节质粒pRevTet-On分别转染入包装细胞PT67,分别收集病毒上清;将含有RevTet-On病毒上清感染IAST,挑选单克隆并瞬时转染报告质粒pRevTRE-Luc,通过检测萤光素酶活性,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低IAST/Tet-On细胞株;再将RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/Tet-On细胞株,得到稳定表达脑啡肽的IAST/Tet-On/hPPE细胞株,通过RT-PCR、免疫细胞化学及间接免疫荧光染色检测该细胞株中强力霉素定量调控脑啡肽的表达.结果:重组逆转录病毒载体pRe-vTRE/hPPE构建成功;经挑选得到了高表达、低背景IAST/Tet-On细胞株,其诱导倍数为20.6;在IAST/Tet-On/hPPE细胞株中,hPPE基因表达受强力霉素调控,呈剂量依赖关系.结论:成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的永生化IAST,为可调控基因治疗慢性疼痛的研究奠定了基础.

强力霉素诱导表达脑啡肽细胞株的构建及其对慢性神经痛大鼠的镇痛作用

目的构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株,并评价鞘内移植该细胞对慢性坐骨神经压榨性损伤(CCI)大鼠的镇痛效应。方法应用逆转录病毒转染法,建立受强力霉素调控表达人前脑啡肽原基因(hPPE)的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/Tet-On/hPPE),实时定量PCR及放射免疫分析法检测强力霉素对该细胞株脑啡肽表达的定量调节。将IAST/Tet-On/hPPE细胞植入CCI大鼠蛛网膜下腔,观察腹腔注射强力霉素对其镇痛效应的影响及免疫组织化学检测脊髓背角Fos蛋白的表达。结果实时定量PCR及放射免疫分析结果显示,强力霉素可定量调控IAST/Tet-On/hPPE细胞株中脑啡肽的表达;IAST/Tet-On/hPPE植入CCI大鼠的蛛网膜下腔后,大鼠机械缩爪阈值升高(P<0.05),脊髓背角浅层Fos蛋白表达明显降低(P<0.05),且该镇痛效应受强力霉素调控。结论成功构建了可调控的定量表达脑啡肽的永生化星形胶质细胞株,其有望成为慢性疼痛治疗的新方法。

大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。

Plv-UbC-HPPE/HEK293细胞对骨癌痛大鼠镇痛作用及其机制的探讨

目的观察鞘内注射稳定表达人前脑啡肽(HEEP)的HEK293细胞对骨癌痛大鼠痛觉的影响,探讨其与脊髓背角蛋白激酶Cγ(PKCγ)表达的关系。方法选取40只雌性SD大鼠,随机分为4组:Naive组,CIBP组,CIBP+HEK293组,CIBP+HPPE组,每组10只。对CIBP组,CIBP+HEK293组,CIBP+HPPE组造骨癌痛模型。模型建立成功后,分别对CIBP+HEK293组和CIBP+HPPE组大鼠鞘内注射Ubc-GFP-L.V/HEK293细胞和Plv-UbC-HPPE/HEK29细胞。术前1d和从术后3d开始每隔3天测定各组大鼠的热缩足反射潜伏期(PWTL)。使用免疫组织化学法检测大鼠脊髓背角PKCγ的表达。结果鞘内注射细胞后,CIBP+HPPE组大鼠各时点PWTL较CIBP组和CIBP+HEK293组明显升高(P<0.05)。CIBP+HPPE组大鼠脊髓背角PKCγ的蛋白表达量明显低于CIBP组和CIBP+HEK293组大鼠(P<0.05)。结论鞘内注射Plv-UbC-HPPE/HEK293细胞使骨癌痛大鼠疼痛明显减轻,其镇痛作用可能与抑制脊髓背角PKCγ的蛋白表达有关。