人凝血酶原复合物中人凝血因子Ⅺ残留量检测方法验证

目的 建立酶联免疫吸附法(ELISA)测定人凝血酶原复合物中人凝血因子Ⅺ残留量的方法,并进行方法验证。方法 人凝血因子Ⅺ将与包被在微滴定板上的捕获抗体结合并发生反应。经过适当的洗涤步骤后,生物素一抗结合到捕获的蛋白质上。过多的一抗被洗掉,结合的抗体与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素反应,加入TMB底物显色,置于酶标仪450 nm波长处检测。对该检测方法的稀释可靠性、准确度、专属性、重复性、中间精密度、线性、范围、耐用性进行验证。结果 该方法准确度、专属性良好,平均回收率为109.2%, RSD值为6.93%;重复性RSD为6.78%,中间精密度RSD为6.75%,精密度良好;线性相关系数r=0.999 9,线性范围内准确度、精确度良好;耐用性验证了孵育时间和试剂盒开启有效期,结果显示孵育时间变化RSD为6.62%,说明该检测方法孵育时间控制在28~32 min,对结果无显著影响;试剂盒开启后按条件保存7 d,前后检测结果RSD为3.84%,说明试剂盒开启后按条件保存7 d对FⅪ检测结果无影响;上述两者结果表明该方法耐用性良好。稀释可靠性结果显示该检测方法检测PCC中FⅪ残留量时存在“钩状”效应,可以通过稀释100~200倍解决。结论 该方法能够满足实验室人凝血酶原复合物中人凝血因子Ⅺ残留量的测定。

高收率人凝血酶原复合物生产工艺优化

目的确定从人血浆中高效提取人凝血酶原复合物的最佳工艺条件。方法以人血浆为原料,人凝血酶原复合物收率为评价标准,通过实验设计(DOE),正交实验以及单因素实验对制备工艺参数进行研究优选。结果最佳工艺条件为:选用DEAE-Sephadex A50凝胶,将凝胶平衡至pH7.6,然后按血浆重量1.7~2.5 g/L加入去除冷沉淀的血浆中吸附40 min;3倍凝胶体积的洗涤液(0.15~0.175 mol/L)NaCl洗涤3次,洗脱液(0.5~2.0 mol/L)NaCl洗脱3~5次;添加稳定剂(肝素35 IU,NaCl)0.1 mol/L超滤透析。结论使用上述优化后工艺生产,最终产品收率(以人凝血因子Ⅸ计)可达到62~63万IU/吨血浆,适合大规模生产。

国产冻干人凝血酶原复合物质量标准的研究

目的通过对国产人凝血酶原复合物 (PCC)质量的研究 ,建立与国际接规的质量标准。方法用人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ (FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ )浓制剂国家标准品 ,采用一期法测定国内用不同原料制备的PCC中FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ的效价 ;用正常人血浆作标准 ,用凝固法检测PCC的总效价及PCC中的肝素。结果用血浆作原料提纯制备的PCC ,FⅣ的效价能达到 1 0IU/ml以上 ,FⅦ效价最低 ;用组分Ⅲ作原料 ,FⅣ活性损失很大 ,只有 2 / 7批次能达到 1 0IU/ml;而FⅦ效价最高。无论用何种原料 ,FⅡ和FⅩ活性均能保持在一定水平。结论从血浆中直接提纯制备PCC ,能有效地保持FⅣ活性 。

人凝血酶原复合物的研究进展

人凝血酶原复合物(Human prothrombin complex concentrate,PCC)是由健康人混合血浆中分离制备的一种血浆蛋白制剂,主要含有依赖于维生素K的凝血酶原(FⅡ)、凝血酶原转化因子(FⅦ)、抗乙型血友病因子(FⅨ)和自身凝血酶原(FX)。在临床上,PCC主要用于治疗乙型血友病和因维生素K缺乏或患肝病而引起的出血症状。近年来,随着PCC分离技术的发展和安全性的提高,PCC的使用量正在逐年增加。本文综述了PCC的制备工艺研究现状、临床使用和安全性。

首批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国家标准品协作标定

目的协作标定首批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国家标准品。方法用世界卫生组织 98 590批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国际标准品 ,采用一期法标定我国首批人凝血因子Ⅱ和Ⅹ浓制剂国家标准品 ,将标准品分别于4℃、2 2℃、37℃保存 5个月 ,进行稳定性考查。结果人凝血因子Ⅱ和Ⅹ国家标准品的效价分别为 1 6 .1IU 支和 1 2 .1IU 支 ,稳定性良好。

人凝血酶原复合物制备工艺研究现状

人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrates,PCC)是一种含有凝血因子II、VII、IX、X四种维生素K依赖性凝血因子,能够促进血液凝固的血浆蛋白制剂。目前,多数生产厂家采用DEAE Sephadex A-50凝胶从混合血浆中制备PCC。PCC制备工艺的选择、制备原料的挑选及质量控制、关键工艺参数的优化及控制等方面对PCC制品的质量至关重要。因此,主要对PCC的制备工艺、制备原料、关键工艺参数的优化及生产过程中凝血因子活化的控制策略进行了综述。

人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价测定影响因素的探讨

目的 探讨几种因素对人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价测定的影响。方法 参照《中国药典》2010年版,采用不同厂家乏Ⅸ因子血浆、不同型号仪器、不同肝素中和方式、不同样品前处理方法测定人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价,分析其对PCC中凝血因子Ⅸ效价测定结果的影响。结果 不同厂家的乏Ⅸ因子血浆对凝血因子效价测定结果有显著性差异（P〈0.05）。不同型号全自动凝血分析仪对凝血因子效价测定结果无显著性差异。当稀释倍数大于60倍时,是否中和肝素对凝血因子Ⅸ效价测定结果影响较小。当稀释倍数小于60倍时,中和肝素的检测结果高于不中和的检测结果,差异有统计学意义（P〈0.05）。样品预温与否及是否复溶15分钟,凝血因子Ⅸ效价测定结果无显著性差异。结论 不同厂家乏Ⅸ因子血浆,不同稀释倍数的肝素中和方式,样品前处理方法均影响PCC制品凝血因子Ⅸ效价的测定,在检测过程中应予以重视。加强对乏因子血浆的质量控制及操作流程的规范化,建立PCC制品凝血因子检测的室间质量评价体系。

人凝血酶原复合物在制备过程中凝血因子活性的检测和分析

目的：对人凝血酶原复合物在制备工艺中凝血因子效价进行检测和分析。方法对PCC制备过程中的血浆、S／D病毒灭活、冻干工艺、干热病毒灭活前和后分别取样，检测分析凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ效价，分别分析S／D病毒灭活、冻干工艺、干热病毒灭活前和后凝血因子效价的变化情况。分析PCC干热病毒灭活后的样品中四种凝血因子的效价比例。结果三批血浆中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性在0．8～1．2 IU／mL之间。 S／D病毒灭活前后PCC 冻干工艺前后PCC中四种凝血因子活性无明显变化，而干热病毒灭活后PCC中四种凝血因子活性均有明显下降。三批PCC中四种凝血因子的比例基本一致，但是凝血因子Ⅶ效价较低，凝血因子Ⅱ效价偏高。结论通过PCC制备工艺中凝血因子效价的检测和分析可实现良好的质量控制。

原料血浆冷沉淀提取工艺过程质量控制

目的:对原料血浆冷沉淀提取工艺过程进行质量控制,保证血浆安全和冷沉淀质量合格。方法:采用双缩脲法检测血浆和冷沉淀蛋白含量。用DR45密度计检测冷沉淀提取前后血浆密度。采用薄膜过滤法检查冷沉淀提取前后血浆微生物限度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和电泳扫描法,分析血浆中白蛋白和Ig G百分含量。采用ACL7000全自动凝血分析仪检测凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅷ效价。检测分析冷沉淀的质量。结果:冷沉淀提取前后血浆蛋白、密度、微生物限度、凝血因子Ⅷ效价明显下降,但血浆中白蛋白、Ig G以及凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ效价无明显变化。5批冷沉淀中FⅧ的收获率均值为61.8%,其质量符合制备人凝血因子Ⅷ的标准。结论:通过对冷沉淀提取工艺过程的质量控制,有效保证了血浆和冷沉淀的质量。

离子交换吸附法提取人凝血酶原复合物工艺优化

目的优化人凝血酶原复合物的离子交换吸附工艺,提高PCC回收率。方法采用单因素试验的方法 ,以人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ吸附率为考察指标,初步优选吸附温度、吸附时间、凝胶用量和血浆pH四个工艺参数。结果优化试验结果为血浆温度20℃、吸附时间60 min、凝胶用量1.5 g/L、血浆pH7.4。结论确定了人凝血酶原复合物提取工艺的条件。

人凝血酶原复合物冻干保护剂及冻干工艺的研究

目的对人凝血酶原复合物冻干保护剂及冻干工艺进行研究,生产出符合中国药典要求的产品,提高人凝血因子Ⅸ回收率。方法通过对冻干保护剂甘氨酸不同添加浓度的研究比较,得到最佳的甘氨酸添加浓度;探讨不同冻干工艺对人凝血酶原复合物的影响,优化得到最佳冻干工艺。结果冻干保护剂甘氨酸的最佳添加浓度为20 g·L^(-1);最佳冻干工艺为:制品快速降温到-45.0℃保持3 h冻结,退火到^(-1)5℃,再冻结,保持3 h后,抽真空,真空度保持在10 Pa左右后,开始加热,升温至0℃升华;升华完毕,梯度升温(每小时升高10~20℃);制品温度升至30℃后,制品进入干燥最后阶段,保持数个小时,温度不超过35℃。结论通过对人凝血酶原复合物处方及冻干工艺进行优化,制备出了符合中国药典要求的冻干产品,人凝血因子Ⅸ收率提高了约18%。

人凝血酶原复合物治疗乙型血友病的有效性和安全性评价

目的评价人凝血酶原复合物(PCC)治疗乙型血友病的有效性和安全性。方法采用多中心、开放、自身对照设计,用目标值法评价PCC的有效性。试验入组54例乙型血友病受试者,根据出血状况和凝血因子水平不同,确定输注的剂量,输注后30 min测定凝血因子Ⅸ效率值,24 h观察出血症状和体征改善,用药结束后90 d检测凝血因子Ⅸ抗体及HBs Ag、抗-HCV和抗-HIV。结果受试者首次输注后30 min,凝血因子Ⅸ活性由2.03%提高至29.49%±14.86%,输注效率值为104.86%±34.45%;输注后24 h,出血症状和体征改善评分经研究者判定:"优良"38.9%(21例)、"改善"61.1%(33例),总改善率为100%;不良反应发生率3.7%(2/54),均为轻度发热,未见凝血因子Ⅸ抗体及新增病毒病例。结论输注本公司生产的人凝血酶原复合物用于治疗乙型血友病,其输注效率值能达到良好水平,出血症状和体征的总改善率达到优良水平,总体安全性良好。

肝素与抗凝血酶Ⅲ对人凝血因子Ⅸ效价检测的影响

目的了解不同浓度水平的肝素、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)或肝素/ATⅢ(1∶1混)对人凝血因子Ⅸ(FⅨ)类制品中FⅨ效价检测的影响。方法向FⅨ或人凝血酶原复合物(PCC)样品中加入不同浓度水平的肝素或肝素/ATⅢ来制备每1 IU FⅨ含0、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2、4 IU的肝素或肝素/ATⅢ的样品以及向FⅨ或PCC样品中单独加入ATⅢ时制备每1 IU FⅨ中含0、0.1、0.5、1 IU ATⅢ的样品后,采用一期凝固法测定所制备样品中的FⅨ效价;取适量制备的含不同肝素浓度的样品,分别加入相应量的硫酸鱼精蛋白中和样品中的肝素后再次测定FⅨ效价。观察并分析不同浓度水平肝素、ATⅢ或肝素/ATⅢ对FⅨ效价检测的影响。结果当样品中每1 IU FⅨ的肝素或肝素/ATⅢ含量为0、0.1、0.3、0.5 IU时,FⅨ效价检测结果较一致;当肝素或肝素/ATⅢ含量为0.8、1、2、4 IU时,FⅨ效价检测结果均低于不含肝素样品的检测结果;ATⅢ含量为0、0.1、0.5、1 IU时,样品中FⅨ效价检测一致。结论当FⅨ或PCC制品中每1 IU FⅨ含肝素或肝素/ATⅢ的量≤0.5 IU时,对FⅨ效价的检测结果无影响,可省略加入硫酸鱼精蛋白中和肝素的步骤;>0.5 IU时,宜加入硫酸鱼精蛋白中和肝素后再检测FⅨ效价。

人凝血酶原复合物提取及纯化工艺的研究

[目的]确定血浆中人凝血酶原复合物提取及纯化的最佳工艺条件。[方法]以人血浆为原料,凝血酶原复合物的吸附率和回收率为评价指标,采用单因素试验及正交试验对提取和纯化条件进行优选。[结果]最佳工艺为:选用pH值为7.0的DEAE-Sephadex A50凝胶从人血浆中提取人凝血酶原复合物,吸附50 min时,凝胶对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附率可达84.0%、86.5%、85.7%和78.0%;采用NaCl浓度为0.1 mol/L、pH值为7.2的洗涤液洗涤吸附后的凝胶5次,然后用NaCl浓度为2.0 mol/L的洗脱液洗脱3次,对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的回收率可达84.9%、76.4%、82.8%和78.7%。[结论]该工艺合理、可行,适合人凝血酶原复合物的工业化生产。

人凝血酶原复合物治疗乙型血友病的多中心Ⅲ期临床研究

目的评价一种人凝血酶原复合物治疗乙型血友病患者的临床疗效和安全性。方法回顾性分析2018年5月至2019年4月期间使用深圳市卫光生物制品股份有限公司生产的人凝血酶原复合物治疗35例乙型血友病患者的临床资料,分析其临床有效性和安全性。结果本试验共35例受试者进入全分析集(FAS)和安全性分析集(SS),33例受试者进入符合方案集(PPS)。FAS受试者首次输注后30 min,凝血因子Ⅸ活性由(3.93±0.975)IU/dL提高至(25.61±9.337)IU/dL,输注效率值为(96.43±22.007)%;凝血因子Ⅱ活性增加值为(73.25±14.874)IU/dL;凝血因子Ⅶ因子活性增加值为(42.79±16.847)IU/dL;凝血因子Ⅹ活性增加值为(65.29±17.042)IU/dL;凝血因子Ⅸ活性增加值为(21.68±9.434)IU/dL。FAS受试者首次输注后24 h,出血症状和体征改善情况为优良的有21例(60%),改善14例(40.0%),有效率为100%。不良反应发生率2.9%(1/35),未见人凝血因子Ⅸ抗体及新增病毒感染。结论输注深圳市卫光生物制品股份有限公司生产的人凝血酶原复合物治疗乙型血友病临床疗效显著且安全性良好。

凝胶吸附罐在人凝血酶原复合物规模化生产中的应用研究

目的研究凝胶吸附罐在PCC生产中的应用效果。方法在1 000 L去冷沉淀血浆规模上使用同一批凝胶生产6批,PCC生产工艺中2次凝胶吸附均在吸附罐中进行。通过回顾性确认方式考察凝胶使用次数,同时考察吸附前后凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性的吸附率、比活性、成品病毒灭活试剂残留情况。结果同批凝胶使用6次生产的PCC成品质量指标均合格,PCC原液外观颜色保持一致,凝胶外观颜色较好。6批PCC成品中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性平均值分别为118.2%、157.0%、140.5%、176.8%。第1、2次吸附的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ活性吸附率平均值为100%,2次吸附凝血因子Ⅶ吸附率平均值分别为75%和81%。PCC成品中凝血因子Ⅸ比活性平均值为0.7 IU/mg。PCC成品中磷酸三丁酯和聚山梨酯80残留量平均值分别为0μg/mL和33μg/mL。同批凝胶在PCC生产过程中可以使用6次。结论凝胶吸附罐在PCC生产中具有良好的应用价值,能够实现工艺放大和自动化控制。

评价人凝血酶原复合物治疗乙型血友病患者的安全性和有效性

目的:评价博雅生物制药集团股份有限公司研制的人凝血酶原复合物治疗乙型血友病患者的有效性和安全性。方法:采用多中心、开放、单组设计开展Ⅲ期临床研究,5家研究中心共入组36例乙型血友病受试者,根据受试者出血的严重程度及凝血因子Ⅸ的需求输注人凝血酶原复合物,以第一次输注结束后30 min凝血因子Ⅸ活性输注效率值为主要疗效指标,以每次出血首次输注后24 h出血症状和体征改善情况及第一次输注结束后30 min凝血因子Ⅸ活性的升高幅度为次要疗效指标。结果:36例受试者均纳入安全性分析集(SS)、全分析集(FAS)和符合方案分析集(PPS),第一次输注结束后30 min凝血因子Ⅸ活性输注效率值为(104.600±21.518)%。第一次输注结束后24 h的出血症状和体征改善评分,基线出血(受试者百分比)和基线后出血(事件百分比)评分优良率分别为83.3%和94.6%,改善率分别为16.7%和5.4%,有效率(优良率+改善率)均为100%。第一次输注结束后30 min凝血因子Ⅸ活性的升高幅度为(29.300±9.254)%。未出现严重不良事件,未见人凝血因子Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ和Ⅹ抗体及新增病毒感染。结论:输注人凝血酶原复合物能够显著提高乙型血友病患者体内的凝血因子Ⅸ活性水平,人凝血酶原复合物总体安全性良好。

人凝血酶原复合物的小鼠急性毒性实验研究

采用完全随机法对小鼠分组,通过剂量摸索性实验、预实验和最大耐受剂量实验对人凝血酶原复合物在小鼠体内的急性毒性进行了初步研究。结果表明:人凝血酶原复合物的最大浓度为16IU/mL,最大体积为0.5mL/20g鼠次;尾静脉注射后,小鼠行为、活动、体重、死亡等指标以及摄食、饮水、大小便均未发生异常;人凝血酶原复合物对小鼠的最大耐受量为800IU/kg,人凝血酶原复合物注射显示的临床剂量安全无毒。

人凝血因子Ⅸ效价测定影响因素的探讨

目的:探讨人凝血酶原复合物中人凝血因Ⅸ因子效价测定的影响因素。方法:考察3种不同的APTT试剂,2种不同的稀释液对人凝血因Ⅸ因子效价测定的影响,以及标准和样品复溶后置-20℃以下冻存的稳定性。结果:3种APTT试剂测定样品结果无显著性差异,但APTT-LS试剂较APTT-XL、Synth Asil-液体APTT试剂的实验精密度高,实验重复性好;咪唑缓冲液与咪唑缓冲液中加入枸橼酸钠、白蛋白,两者测定结果、精密度无显著性差异;标准与样品复溶后置-20℃以下冻存,35天内使用有效。

氢化物-原子吸收光谱法测定人凝血酶原复合物中锑的含量

目的建立人凝血酶原复合物中锑含量的测定方法。方法使用氢化物-原子吸收光谱法测定人凝血酶原复合物中锑的含量。结果锑含量在0-25.0 ng/ml范围内呈良好的线性关系,相关系数大于0.99;检出限为0.5533 ng/ml,定量限为1.844 ng/ml;加样回收率为95.93%-118.62%。结论本研究所建立方法简单、快速、灵敏度高,可用于测定人凝血酶原复合物锑的含量。