腺苷三磷酸对人横纹肌肉瘤细胞系P^(21)和c-myc蛋白表达的影响

为进一步研究腺苷三磷酸抑制癌细胞增殖诱导分化的作用机理，用ＡＴＰ作用于人横纹肌肉瘤单细胞克隆亚系ＲＤＬ６细胞，用免疫荧光细胞化学方法观察ＡＴＰ作用后的ＲＤＬ６细胞核内Ｐ２１蛋白表达增强，ｃ－ｍｙｃ蛋白表达降低，膜下胞质内微丝束－应力纤维组装改善，粘着斑内的主要粘附蛋白——纽蛋白（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）表达增强，正常小鼠成肌细胞Ｃ２Ｃ１２细胞核内Ｐ２１蛋白高表达，ｃ－ｍｙｃ蛋白不表达。结果表明：ＲＤＬ６细胞Ｐ２１表达的丢失和ｃ－ｍｙｃ表达的活化与细胞的增殖和分化异常相关，从而表明Ｐ２１表达增强和ｃ－ｍｙｃ表达的降低在ＲＤＬ６细胞表型逆转过程中起重要作用。

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖凋亡的影响及其作用机制

目的:探讨苦参碱(Matrine,Ma)对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖凋亡的影响及其作用机制。方法:将我组经体外培养的人横纹肌肉瘤RD细胞随机分为实验组和对照组。其中,实验组又分为3个小组且3个小组的细胞中分别加入浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml和1.5mg/ml的苦参碱,对照组细胞中不加入苦参碱。然后应用MTT比色法检测苦参碱对横纹肌肉瘤RD细胞增殖的影响;应用流式细胞仪(FCM)检测苦参碱对横纹肌肉瘤细胞凋亡的影响;应用RT-PCR检测不同浓度苦参碱作用后fas、caspase3等凋亡相关基因的mRNA表达水平。结果:①在抑制RD细胞增殖、诱导RD细胞凋亡方面,实验组和对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组可明显抑制RD细胞增殖、诱导RD细胞凋亡,且作用效果与剂量相关。②将浓度为2.0mg/ml的苦参碱作用于RD细胞24h后,细胞增殖的抑制率和凋亡率分别为(50.49±0.076)%和(39.43±0.487)%。③实验组caspase3和FasmRNA的表达较对照组明显增强(P<0.05)。结论:苦参碱能有效抑制人横纹肌肉瘤RD细胞增殖、诱导人横纹肌肉瘤RD细胞凋亡,且caspase3和FasmRNA等相关基因可能参与了苦参碱抑制RD细胞增殖和诱导RD细胞凋亡的过程。

大蒜素对人横纹肌肉瘤RD细胞的作用及其机制

目的探讨大蒜素(allicin)对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖和凋亡的作用及其相关机制。方法应用不同浓度大蒜素(5,10,20,30μg/ml)作用人横纹肌肉瘤RD细胞株24h,采用MTT比色法检测不同浓度大蒜素下RD细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测不同浓度大蒜素作用后RD细胞的凋亡率。结果 MTT比色法检测各实验组增殖抑制率分别为(25.82±1.75)%、(31.04±1.61)%、(36.32±1.61)%、(42.58±3.88)%;流式细胞仪检测对照组及各实验组凋亡率分别为(5.23±0.80)%、(7.07±0.83)%、(10.60±2.51)%、(15.70±1.79)%、(19.33±0.72)%。以上检测各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大蒜素能有效抑制RD细胞的增殖,诱导其凋亡。

基于转录组测序的EV71感染RD细胞的基因表达变化研究

目的基于转录组测序技术探讨肠道病毒71型(EV71)感染对人横纹肌肉瘤(RD)细胞自噬和免疫的影响及其作用机制。方法用不同剂量EV71感染RD细胞确定感染复数(MOI)。在MOI=1时选择不同时间点(0、0.5、1、1.5、3、6、9和12 h)共8组进行后续实验。倒置显微镜观察细胞形态和数量变化;蛋白免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达情况;运用转录组测序技术分析细胞功能及基因表达的变化;高内涵细胞成像技术观察细胞内蛋白表达情况。结果倒置显微镜可见细胞在病毒感染3 h由梭形贴壁逐渐变为圆形悬浮,细胞数量相比0 h明显减少(P<0.05)。Western blot结果显示细胞在感染后6 h、9 h、12 h,病毒在RD细胞内已经表达病毒衣壳蛋白1(VP-1),感染后9 h自噬相关蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ与0 h组相比明显升高(P<0.01)。转录组测序结果显示EV71感染RD细胞后3 h细胞内基因表达变化达到峰值,上调基因1199个,下调基因126个。KEGG分析提示改变的信号通路分子大多与自噬和免疫相关。高内涵细胞成像显示细胞在感染后数量减少,细胞内自噬蛋白平均荧光强度增加(P<0.05)。结论EV71感染RD细胞通过自噬相关信号通路促进病毒在细胞内完成复制和组装。

瑞德西韦对感染肠道病毒71型的人横纹肌瘤细胞和ICR乳鼠的抗病毒活性

目的:探讨瑞德西韦(RDV)在细胞与动物水平对肠道病毒71型(EV71)的抗病毒活性,并阐明其抗病毒作用机制。方法:基于人横纹肌瘤(RD)细胞进行RDV抗肠道病毒活性评价,检测RDV对EV71、柯萨奇病毒A6型(CA6)、肠道病毒D68型(EVD68)和柯萨奇病毒16型(CA16)的半数毒性浓度(CC50)和半数有效浓度(EC50),计算选择指数(SI)。将RD细胞分为细胞对照组(不处理)、病毒对照组和给药组。病毒对照组RD细胞给予EV71病毒液,给药组RD细胞再给予不同浓度(0.005、0.015、0.046、0.137、0.410、1.230、3.700、11.110、33.330和100.000μmol·L^(-1))RDV。72 h后,采用CellTiter-Glo?Luminescent检测试剂盒测定各组RD细胞活性。在抗EV71细胞活性评价实验中,将RD细胞分为给药组和病毒对照组,给药组RD细胞给予不同浓度(0.03、0.10、0.30、0.80和2.50μmol·L^(-1))RDV。30 h后,采用实时荧光定量PCR(RTqPCR)法检测各组RD细胞中EV71 RNA表达水平,采用Western blotting法和免疫荧光法检测各组RD细胞中EV71结构蛋白VP1表达量。采用加药时序实验验证RDV的抗病毒作用阶段。在抗EV71动物药效学实验中,将35只ICR乳鼠随机分为安慰剂组(给予2%Tween 80,n=12)、3.0 mg·kg^(-1)RDV组(给予3.0 mg·kg^(-1)RDV,n=12)和1.5 mg·kg^(-1)组RDV组(给予1.5 mg·kg^(-1)RDV,n=11),每只乳鼠经腹腔攻毒5×103PFU。4 h后进行第1次给药,连续给药2周,观察并记录乳鼠生存率。在攻毒后第3天采用RT-qPCR法检测各组乳鼠各种组织中病毒载量(即EV71 RNA拷贝数)。结果:RDV对EV71、CA6、EVD68和CA16的EC50分别为(0.05±0.01)、(0.14±0.06)、(0.02±0.01)和(0.10±0.03)μmol·L^(-1)。与病毒对照组比较,0.10、0.30、0.80和2.50μmol·L^(-1)RDV组RD细胞中EV71 RNA表达水平降低(P<0.05或P<0.01),0.80和2.50μmol·L^(-1)RDV组RD细胞中EV71结构蛋白VP1表达量降低。与病毒对照组比较,0.80μmol·L^(-1)RDV组RD细胞中Ⅲ和Ⅳ阶段(病毒复制阶段)时EV71病毒基因组RNA拷贝数明显降低(P<0.05)。与安慰剂组比较,各给药组乳鼠生存率差异无统计学意义(P>0.05),但有一定的保护趋势。与安慰剂组比较,3.0 mg·kg^(-1)RDV组乳鼠肺和肌肉组织中病毒载量明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:RDV对以EV71为代表的肠道病毒具有良好的细胞水平抗病毒活性,并主要作用于病毒感染后的复制阶段。RDV能明显降低小鼠肺和肌肉组织中病毒载量,提示其在动物水平有一定的治疗潜力。

柯萨奇病毒A组10型感染RD细胞的转录组学分析

探讨柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV⁃A10)感染人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞的基因表达谱变化,为深入理解CV⁃A10致病机制提供重要基础数据。本研究将CV⁃A10以感染复数(MOI)为0.1的剂量感染RD细胞12 h后提取总RNA,通过RNA⁃Seq技术获取RD细胞中的全部转录本信息,基于生物信息学的方法对差异表达基因进行GO(gene ontology,GO)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。结果显示,共筛选到2610个差异表达基因,其中表达上调的基因有1582个,表达下调的基因有1028个。随机选取8个差异表达基因,经RT⁃qPCR验证后发现,其变化趋势与转录组数据一致。GO和KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要聚焦于细胞内信号转导、mRNA加工、抗病毒免疫反应等过程。结果表明,CV⁃A10感染可能会引起RD细胞发生自噬。

重组人干扰素α1b抗肠道病毒71型的作用机制研究

目的研究重组人干扰素α1b（IFN-α1b）体外对肠道病毒71型（EV71）复制的抑制作用，并初步探讨其抗病毒机制。方法测定IFN—α1b对RD细胞的毒性和IFN-α1b在EV71感染前后给药对EV71感染所致的RD细胞病变的抑制作用，检测IFN—α1b对EV71RNA和VP蛋白表达量以及病毒复制的影响，并通过构建瞬时表达干扰素诱导的跨膜蛋白3（M3）的RD细胞探索IFN—α1b通过促进IFFFM3的表达，抑制EV71侵入的作用机制。结果在EV71感染前12h和感染后1h给药，IFN-αlb抑制EV71细胞病变的IC50值分别为258．53IU／ml和2113．58IU／ml，选择指数SI分别为〉16497和〉3271，提示IFN—α1b具有明显的抗EV71活性，且在EV71感染前给药效果更明显。机制研究显示，与对照组相比，IFN—α1b可显著抑制EV71的RNA复制、蛋白合成和子代病毒释放，且可能通过对IFITM3的诱导表达阻止EV71侵入。结论IFN-αb具有抗EV71活性，可通过影响病毒生命周期的侵入、复制、装配和释放过程达到抗病毒作用。

LncRNA RMST在GMA诱导16HBE人支气管上皮细胞恶性转化过程中的表达及意义

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)横纹肌肉瘤相关转录物-2(RMST)在甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中的表达特征及生物学意义。方法收集GMA转化组和DMSO对照组的第10、20和30代细胞,高通量芯片分析LneRNA RMST在转化不同时期的表达改变,对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测LncRNA RMST和可能相互作用的miRNA相对表达量。结果芯片结果显示,与对照组相比,LncRNA RMST在转化的前期(P10)、中期(P20)和后期(P30)分别上调4.75倍、上调1.90倍和下调2.53倍,且相对表达量呈下降趋势。LneRNA RMST表达变化趋势的qPCR验证结果与芯片结果一致,而3个时期miR-135a-2相对表达量的差异均无统计学意义(P >0.05)。结论LncRNA RMST在GMA诱导16HBE细胞恶性转化的早、中期高表达,在转化完成时低表达,并呈下降的趋势;LncRNA RMST可以作为GMA诱导16HBE细胞恶性转化的相关分子标志物,其功能和作用机制有待进一步研究。

基于RNA-seq技术研究埃可病毒30型感染RD细胞前后的差异表达基因

埃可病毒30型(Echovirus 30,E30)是一种全球传播的B组肠道病毒,常与无菌性脑膜炎等疾病暴发有关,分析E30在感染人横纹肌肉瘤(Human rhabdomyosarcoma,RD)细胞前后的差异表达基因有助于了解该病毒的复制周期以及宿主感染机制。本研究通过转录组测序技术探究E30感染RD细胞前后的基因表达谱变化,共检测到的1281个差异表达基因,其中包括730个下调基因和551个上调基因。基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明,显著差异表达基因主要参与细胞受体信号通路的调节、炎症反应、免疫细胞活化、调控细胞生命周期等。利用荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,qPCR)对其中9个与炎症和免疫反应相关的差异表达基因进行验证,发现DEAD-box解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3,DDX3)表达上调,这与转录组学分析一致。利用RK-33(DDX3的小分子抑制剂)靶向抑制DDX3的表达,发现RK-33能够抑制E30的复制,并且qPCR结果显示在抑制DDX3的表达后,GTP酶激活蛋白结合蛋白1(GTPase-activating protein-binding protein1,G3BP1)和干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor 3,IRF3)的表达也出现不同程度地降低。本研究的结果提示DDX3表达可能影响E30复制,这一发现为进一步探索E30在感染宿主过程中的分子机制奠定基础。

人用疫苗检定用MRC-5和人横纹肌肉瘤细胞的短串联重复序列图谱鉴定

目的用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因分型法对人用疫苗检定用MRC-5和人横纹肌肉瘤细胞进行鉴定,确认无污染。方法选取人源细胞的20个STR位点进行等位基因PCR扩增及荧光检测,将得到的STR图谱与美国典型培养物保藏中心和德国微生物菌种保藏中心数据库比对分析。结果两株细胞均得到清晰的STR特征性图谱,未出现3单位基因,在两个数据库中均找到与其细胞分型完全匹配的细胞株。结论人用疫苗检定用MRC-5和人横纹肌肉瘤细胞均为正确细胞株,不存在污染和交叉污染。